微生物純度驗(yàn)證

1范圍本規(guī)程規(guī)定了古菌、細(xì)菌、真菌、病毒（種）純度檢測(cè)的程序和方法。本規(guī)程適用于從事微生物菌種資源保藏及研究的機(jī)構(gòu)、大學(xué)、企業(yè)、個(gè)人等。2術(shù)語(yǔ)、定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)程2.1純度檢測(cè)puritycheck指通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)菌種是否為純培養(yǎng)物。2.2純培養(yǎng)pureculture由單個(gè)細(xì)胞的后代組成的培養(yǎng)物，即單細(xì)胞培養(yǎng)物或無(wú)性繁殖系。通常是由挑取單個(gè)菌落或利用單胞分離技術(shù)，移種繁殖獲得。3.菌種的純度檢測(cè)3.1古菌和細(xì)菌的純度檢測(cè)3.1.1菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測(cè)培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線(xiàn)，適宜培養(yǎng)后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對(duì)于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應(yīng)再分別挑取單菌落劃線(xiàn)或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測(cè)是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。3.1.2細(xì)胞形態(tài)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性；細(xì)胞形狀、大小、莢膜等特征應(yīng)相似3.1.3芽抱大小、位置、形狀宜檢測(cè)樣品是否形成芽抱，對(duì)形成芽抱的菌種，其芽抱大小、位置、形狀應(yīng)相似。3.2放線(xiàn)菌菌種純度檢測(cè)3.2.1菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測(cè)培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線(xiàn)，挑取單菌落，適宜培養(yǎng)后，在同一平板上單菌落形狀、大小、表面狀況、質(zhì)地、光澤、顏色等應(yīng)相似。如懷疑為細(xì)菌污染，則30°C液體培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)液不應(yīng)渾濁，如渾濁則視為細(xì)菌污染。3.2.2培養(yǎng)特征分別接種三種以上培養(yǎng)基，在三種以上培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征應(yīng)相同，包括氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、可溶性色素的顏色等。3.2.3抱子絲及抱囊在特定的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間等條件下，抱子著生方式、抱子絲形態(tài)及其顏色或抱囊著生位置（氣絲或基絲）、抱囊的形狀，大小應(yīng)呈現(xiàn)出一致性。3.3酵母菌種純度檢測(cè)3.3.1菌落形態(tài)應(yīng)對(duì)菌落形態(tài)相似性進(jìn)行檢測(cè)。在特定的培養(yǎng)基上，通過(guò)對(duì)待檢測(cè)菌株進(jìn)行稀釋或劃線(xiàn)涂布平板獲取單菌落，一定的培養(yǎng)條件下，比較同一平板內(nèi)，菌落的大小、形狀、顏色、隆起、表面狀況、質(zhì)地、光澤等應(yīng)一致。3.3.2個(gè)體形態(tài)應(yīng)對(duì)檢測(cè)樣品的個(gè)體形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。在指定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，細(xì)胞形狀、大小及細(xì)胞的增殖方式應(yīng)一致。3.3.3繁殖方式酵母繁殖的方式應(yīng)一致，如是芽殖，出芽的方位、數(shù)量應(yīng)一致。3.4絲狀真菌菌種純度檢測(cè)3.4.1菌落特征菌落的形態(tài)等表觀特征應(yīng)一致。3.4.2菌絲特征在特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌絲分隔、菌絲形態(tài)等應(yīng)一致。3.4.3其他主要顯微特征應(yīng)一致3.4.4檢測(cè)是否有細(xì)菌污染3.4.5對(duì)于外觀上不能確定菌種純度的，利用單胞分離技術(shù)獲得純培養(yǎng)物進(jìn)行對(duì)比，其菌絲、抱子等特征應(yīng)與原始菌株的描述一致。3.5病毒的純度檢測(cè)3.5.1純粹檢查應(yīng)將待檢病毒液直接接種含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（G.A）、葡萄糖蛋白胨湯。通過(guò)一定溫度時(shí)間培養(yǎng)后，檢查結(jié)果應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)為純粹。3.5.2支原體檢查檢測(cè)由禽胚組織或其細(xì)胞所培養(yǎng)的病毒應(yīng)用改良Frey氏培養(yǎng)基。檢測(cè)其它培養(yǎng)方法所得病毒應(yīng)用支原體培養(yǎng)基。任何一次瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落，判為陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照中至少有一個(gè)平板長(zhǎng)菌落，而陰性對(duì)照中無(wú)菌落生長(zhǎng)，則檢驗(yàn)有效。3.5.3外源病毒檢查病毒類(lèi)制品在毒種選育和生產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)常使用動(dòng)物或細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)，因此，有可能造成外源因子（特別是外源病毒因子）的污染。為了保證制品質(zhì)量，需要對(duì)毒種和細(xì)胞進(jìn)行外源因子檢測(cè)。3.5.3.1對(duì)病毒主種子批或工作種子批，應(yīng)抽取足夠檢測(cè)試驗(yàn)需要量的供試品進(jìn)行病毒外源因子檢測(cè)。在試驗(yàn)前應(yīng)用特異性抗體（血清）中和本病毒（或單克隆抗體），所用的抗體免疫源應(yīng)采用與生產(chǎn)疫苗（或制品）不同種而且無(wú)外源因子污染的細(xì)胞（或動(dòng)物）制品。如果病毒曾在禽類(lèi)組織或細(xì)胞中繁殖過(guò)，則抗體不能用禽類(lèi)來(lái)制備。若用雞胚，應(yīng)來(lái)自SPF雞群。以下方法可以選擇一種或多種進(jìn)行。3.5.3.1.1動(dòng)物試驗(yàn)法3.5.3.1.1.1小鼠試驗(yàn)法取15-20g小鼠至少10只，用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，每只腦內(nèi)接種0.03ml，同時(shí)腹腔接種0.5m1。至少觀察21天。在觀察期內(nèi)至少有80%最初接種的小鼠存活，試驗(yàn)才有效。如果沒(méi)有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所用在試驗(yàn)24小時(shí)后死亡或有患病體征的小鼠，直接觀察期病理改變，并將有病變的相應(yīng)的組織懸液通過(guò)腦內(nèi)和顱腔接種另外至少5只15-20g小鼠，并觀察21天，如果沒(méi)有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.1.2乳鼠試驗(yàn)法取出生后24小時(shí)內(nèi)的乳鼠至少10只，用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，腦內(nèi)接種0.01ml,同時(shí)腹腔接種至少0.1m1。每天觀察，至少14天。在觀察內(nèi)至少有80%最初接種的乳鼠存活，試驗(yàn)才有效。如果沒(méi)有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所有在試驗(yàn)24小時(shí)后死亡或有患病體征的乳鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應(yīng)的組織和腦、脾制備成懸液通過(guò)腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只出生后24小時(shí)內(nèi)乳鼠，并每天觀察至接種第14天，如果沒(méi)有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)法3.5.3.1.2.1非血吸附檢查用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，接種于生產(chǎn)用的同種的細(xì)胞。細(xì)胞至少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25%。于36±1°C培養(yǎng)，觀察14天，必要時(shí)可更換細(xì)胞培養(yǎng)液，未見(jiàn)細(xì)胞病變（CPE）為陰性，符合要求。3.5.3.1.2.2血吸附病毒檢查上述接種病毒的各個(gè)細(xì)胞于第6-8天后和第14天，取出2瓶進(jìn)行血吸附病毒檢查。用0.2%—0.5%雞和豚鼠紅細(xì)胞混合菌懸液覆蓋于細(xì)胞表面，分別置于2—8°C,20—25°C,30分鐘后顯微鏡下觀察，未見(jiàn)血球吸附現(xiàn)象為陰性，符合要求。3.5.3.1.3雞胚檢查法在禽類(lèi)組織或細(xì)胞中繁殖過(guò)的病毒種子需用雞胚檢查禽類(lèi)病毒的污染。選用9—11日和5—7日齡兩組SPF雞胚，每組至少5只，分別于尿囊腔和卵黃囊接種經(jīng)抗體血清中和后的病毒懸液，每胚0.5m1。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和雞血細(xì)胞混合懸液做血球凝集試驗(yàn)應(yīng)為陰性。被接種的雞胚至少80%存活7天，試驗(yàn)有效。3.5.3.2生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查3.5.321細(xì)胞直接觀察每批生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)留取5%（或不少于500ml），細(xì)胞懸液不接種病毒，作為對(duì)照細(xì)胞加入與疫苗生產(chǎn)相同的細(xì)胞維持液，置于與疫苗生產(chǎn)相同的條件下培養(yǎng)，觀察14天，在顯微鏡下觀察是否有細(xì)胞病變（CPE）出現(xiàn)，