同位素標(biāo)記衍生化液質(zhì)-itraq

iTRAQ定量分析蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ定量分析蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)簡介iTRAQ試劑標(biāo)記原理iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢iTRAQ實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例iTRAQ實(shí)驗(yàn)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ簡介iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側(cè)鏈氨基連接的胺標(biāo)記同重元素。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ試劑標(biāo)記原理iTRAQ包括三部分：報(bào)告部分、肽反應(yīng)部分、平衡部分。

1、報(bào)告部分有八種：114-121，因此iTRAQ可同時(shí)標(biāo)記8組樣品。

2、肽反應(yīng)部分：能與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接而標(biāo)記上肽段，幾乎可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)。

3、平衡部分：保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢1：靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；2：分離能力強(qiáng),分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。3:高通量：同時(shí)對8個(gè)樣本進(jìn)行分析，提高了實(shí)驗(yàn)通量，可同時(shí)對多個(gè)時(shí)間點(diǎn)或不同處理的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析；

4：結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；5：自動化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程iTRAQ技術(shù)流程。

1：樣本經(jīng)過不同處理后提取蛋白質(zhì)；

2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后胰蛋白酶酶切；

3：肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標(biāo)記；

4：等量混合各種iTRAQ試劑標(biāo)記的肽段；

5：MS/MS質(zhì)譜檢測及分析。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例iTRAQ定量分析結(jié)果。

1:蛋白質(zhì)肽段經(jīng)過四種iTRAQ（114-117）試劑標(biāo)記后，例如，對照用iTRAQ117標(biāo)記，其他三個(gè)處理分別用iTRAQ114,115,116標(biāo)記，等量混合標(biāo)記后的樣本，液相分離和質(zhì)譜分析.2:上圖是蛋白質(zhì)同一個(gè)肽段經(jīng)過不同處理的二級質(zhì)譜峰圖，通過檢索可以鑒定出這個(gè)肽段。

3:蛋白質(zhì)不同處理后蛋白質(zhì)的表達(dá)變化可以通過二級質(zhì)譜中iTRAQ試劑的峰度及面積確定，如下圖所示，三個(gè)處理組（114-116）相對對照其表達(dá)量升高。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟—ABI試劑盒輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟1：蛋白質(zhì)提取

可以選取各種提取蛋白質(zhì)的常規(guī)溶液，裂解液里最好不要包括下面試劑，因?yàn)檫@些試劑會干擾iTRAQ試劑標(biāo)記反應(yīng)。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟2：蛋白質(zhì)定量

2.1：可以采用Bradford方法及其他方法定量初步定量

2.2：取各組相同蛋白質(zhì)SDS-APGE電泳，銀染定量，根據(jù)每個(gè)涌道染色情況調(diào)整，使每組樣本量相同。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟3：酶切，標(biāo)記（1）每組樣本（各100ug）分別加入-20度預(yù)冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20度沉淀30分鐘-4小時(shí)（根據(jù)樣品所需沉淀量選擇時(shí)間，一般開始時(shí)可選1小時(shí)）；（2）12000rpm離心15分鐘，棄上清，用試劑盒中自帶的溶解液dissolutionbuffer（20uL）和1%SDS(1ul)充分混懸溶解樣品；（3）加入還原試劑2ul，混勻，60度反應(yīng)1小時(shí)；（4）加入半胱氨酸封閉試劑（cystineblockingregent）1ul,室溫處理10分鐘；（5）按照酶：蛋白質(zhì)=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解過夜（16h）；

(6)113,114,115,116,117,118,119,121各管標(biāo)記試劑中加入50uL異丙醇(試劑盒中自帶），混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應(yīng)一小時(shí)，之后各加入三倍體積水，使標(biāo)記試劑分解。標(biāo)記和樣品對應(yīng)關(guān)系如下:4R—117,未知—118，BOO6—119,11R—121；

(7)合并各管標(biāo)記好的樣品，真空冷凍干燥。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟4：除鹽，此步操作是將標(biāo)記過程中的標(biāo)記試劑和相關(guān)buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。（1）100%乙腈沖洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上（4）0.1%TFA沖洗柱子3-5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400uL洗脫下樣品（6）將樣品冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)分析。輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟第一維強(qiáng)陽離子柱(SCX)分離（1）6.1儀器及試劑：1）色譜儀20AD（島津），2）真空離心濃縮機(jī)rotationvacuumconcentrators（ChristRVC2-25，Christ，Germany），3）磷酸二氫鉀（國藥集團(tuán)），4)氯化鉀（國藥集團(tuán)），5)乙腈ACN(Fisher)（2）具體操作參數(shù)柱子信息：Polysulfoethylcolumn,2.1mm*100mm,5u,200A,TheNestGroup,Inc.MAA相：10mMKH2PO4，25%CAN，PH2.6B相：10mMKH2PO4，350mMKCl，25%ACN，PH2.6

紫外檢測波長：214nm/280nm

流速：200uL/min

梯度：60min，輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：B%從5分鐘5%到40分鐘上升至25%Time(min)B%0 05 540254580508051060stop根據(jù)峰型和時(shí)間共收取20個(gè)梯度,真空離心濃縮后，用50uLRPLCA相（5%ACN,0.1%甲酸（TEDIA,Fairfield,USA）溶解，進(jìn)行第二維分析輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟6：第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS（1）儀器及試劑，色譜儀20AD（島津），質(zhì)譜儀QSTARXL（AppliedBiosystem,USA），乙腈ACN(Fisher)，甲酸（TEDIA）（2）具體操作參數(shù)反相柱信息：ZORBAX300SB-C18column(5μm,300?,0.1x150mm,microm,USA)

色譜分離90min，梯度B%從5分鐘5%到70分鐘上升至35%A相：5%ACN,0.1%甲酸

B相：95%ACN,0.1%甲酸流速：300nL/min輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟Time(min)B%55%9035%9580%10080%1055%120stop質(zhì)譜鑒定：MS掃描范圍400-1800

MS/MS掃描范圍100-2000IDA采集模式一個(gè)圖譜選擇四個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級掃描輝駿生物：免費(fèi)服務(wù)熱線：7:數(shù)據(jù)檢索(1)蛋白質(zhì)檢索檢索軟件：ProteinPilot3.0(ABI,USA)(2)蛋白質(zhì)功能檢索數(shù)據(jù)庫：