MTT比色試驗(yàn)、克隆形成試驗(yàn)

常用測(cè)定細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)方法：MTT比色試驗(yàn)、克隆形成試驗(yàn)常用測(cè)定細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)方法活細(xì)胞計(jì)數(shù)法：費(fèi)時(shí)，有一定主觀性MTT比色法：簡(jiǎn)便，大樣本、靈敏度較高，重復(fù)性好結(jié)晶紫染色法：與MTT法類(lèi)似，但步驟多克隆形成法：反映干細(xì)胞增殖能力，周期長(zhǎng)流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞周期分布，成本高同位素?fù)饺敕ǎ?H-TdR,125I-UdR摻入DNA，反映S期細(xì)胞活性，精度最高，但有放射性ATP生物發(fā)光法：靈敏度高，與MTT法類(lèi)似MTT比色試驗(yàn)原理MTT比色試驗(yàn)步驟接種:細(xì)胞密度103~105/ml,體積100~200l培養(yǎng):37℃、5％CO2、飽和濕度，培養(yǎng)24h施加干預(yù)因素：培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（1-5d）呈色:終止培養(yǎng)前4～6h，每孔加5mg/mlMTT20l，繼續(xù)培養(yǎng)溶解:每孔加DMSO150l，振蕩5min比色:492nm波長(zhǎng)，測(cè)定光吸收值（A）繪制曲線：以細(xì)胞數(shù)或作用因素（如藥物濃度）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制曲線MTTASSAYCellsuspension105/ml3.2×104/ml104/ml0.32ml0.1mlMedium0.68ml0.1ml0.9ml0.9ml3.2×103/ml3.2×105/ml0.9ml0.1mlMTTASSAYMTTASSAY

103

3.2×1033.2×104

104105

MTT比色試驗(yàn)注意事項(xiàng)培養(yǎng)板：貼壁型細(xì)胞－平底培養(yǎng)板懸浮型細(xì)胞－U型培養(yǎng)板細(xì)胞密度：不同細(xì)胞須選擇適當(dāng)?shù)拿芏萂TT溶液：4℃避光保存，出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)棄去；部分細(xì)胞需摸索MTT作用最佳濃度和時(shí)間殘留血清和培養(yǎng)液會(huì)影響吸光值注意控制吸光值與細(xì)胞數(shù)之間線性范圍，一般為102～105MTT比色試驗(yàn)應(yīng)用舉例藥物敏感性試驗(yàn)生物材料細(xì)胞毒測(cè)定放射效應(yīng)測(cè)定冷凍殺傷效應(yīng)測(cè)定高溫殺傷效應(yīng)測(cè)定激光效應(yīng)測(cè)定磁場(chǎng)效應(yīng)測(cè)定補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒測(cè)定克隆形成試驗(yàn)概念：克隆指單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)分裂繁殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群。光鏡下，大于50個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)為1個(gè)克隆。方法：1.平皿克隆形成試驗(yàn):適用于貼壁型細(xì)胞，如正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞；控制細(xì)胞遷移2.軟瓊脂克隆形成試驗(yàn):適用于腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞；無(wú)細(xì)胞遷移；底層為0.5%瓊脂，上層為0.3%瓊脂(含細(xì)胞)。用途：多用于藥物、放射敏感性試驗(yàn)。平皿克隆形成試驗(yàn)軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)2人為1組，每塊96孔板共4人操作預(yù)先接種細(xì)胞數(shù):103、3.2×103、104、3.2×104、105/0.2ml/孔預(yù)先常規(guī)培養(yǎng)預(yù)先加入MTT0.02ml,孵育6h吸出上清液，加入DMSO0.2ml,振蕩5`490nm比色，手工記錄吸光值