免疫磁珠分離技術(shù)及其應(yīng)用

免疫磁珠分離技術(shù)及其應(yīng)用前言免疫磁珠分離技術(shù)介紹免疫磁分離技術(shù)的應(yīng)用一、前言免疫磁珠分離技術(shù)(Immunomagneticbeadssep—arationtechniques，IMB)是將免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性與磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合的一種新的免疫學(xué)技術(shù)；是一種特異性強(qiáng)、靈質(zhì)純化敏度高的免疫學(xué)檢測方法和抗原純化手段。是近年來國內(nèi)外研究較多的一種新的免疫學(xué)技術(shù)。目前該項技術(shù)在細(xì)胞分離、蛋白、免疫學(xué)及微生物學(xué)檢測等方面均取得了較大的進(jìn)展，是目前最有推廣價值的技術(shù)之一。二、免疫磁珠分離技術(shù)1、免疫磁珠分離技術(shù)原理利用人工合成的內(nèi)含鐵成分，可被磁鐵磁力所吸引，外有功能基團(tuán)，可結(jié)合活性蛋白質(zhì)(抗體)的磁珠，作為抗體的載體。當(dāng)磁珠上的抗體與相應(yīng)的微生物或特異性抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物具有較高的磁響應(yīng)性，在磁鐵磁力的作用下定向移動，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，而達(dá)到分離、濃縮、純化微生物或特異性抗原物質(zhì)的目的。2、免疫磁珠法分類⑴、陽性分離法磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞⑵、陰性分離法磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場的細(xì)胞為所需細(xì)胞

一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用的更多。3、磁性微珠(magneticbeads):磁性微珠是以金屬離子為核心，外層均勻包裹高分子聚合體的固相顆粒。磁性微珠上既可標(biāo)記針對某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體（直接法）;也可標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(間接法），使分離細(xì)胞的范圍大大擴(kuò)大4、免疫磁性微球的制備磁性微載體的制備：

包埋法：將磁性粒子分散于高分子溶液中，通過霧化、絮凝、沉積、蒸發(fā)等手段得到磁性高分子微球。

單體聚合法：在磁性粒子和單體存在下，加入引發(fā)劑、穩(wěn)定劑等聚合而成的核/殼式磁性高分子微球。基本技術(shù)路線：制成磁性材料的微球，再在微球表面引入活性基團(tuán)，通過載體表面偶聯(lián)反應(yīng)可將抗體結(jié)合到載體上，形成免疫磁性微球。優(yōu)質(zhì)微載體的性能：合適且均一的磁響應(yīng)強(qiáng)度,

較小且均一的粒徑,

穩(wěn)定均一、特異吸附的表面性能?？贵w與磁性載體的結(jié)合：磁性微載體表面的高分子層活化后懸于抗體溶液中，在室溫或低溫(冰水浴)下?lián)u動一段時間即可將抗體連接到微球表面上，得到免疫磁性微球。5、該技術(shù)的主要優(yōu)點⑴、細(xì)小而均一的微球為配基與受體的反應(yīng)提供了較大的接觸面積⑵、磁珠的磁性使其可以用磁力收集器方便快速地獲得分離，且對被分離物無損傷⑶、檢測復(fù)雜的生物樣本和食品樣本等時受到顆粒性雜質(zhì)等的影響較?、?、作為一種流動性的固相支持物，其洗滌和反應(yīng)都進(jìn)行得更加充分三、免疫磁性微球的應(yīng)用1、用于細(xì)胞分離和提純使用IMB進(jìn)行分離細(xì)胞有兩種方式；直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法，稱為陽性分離；用免疫磁珠去除無關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離。免疫磁珠技術(shù)可用來分離人類各種細(xì)胞如紅細(xì)胞、外周血嗜酸/堿性粒細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞、造血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞，人類關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、及多種腫瘤細(xì)胞等。2、體外細(xì)胞擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DC)、造血干、祖細(xì)胞等細(xì)胞在科研及臨床上都具有巨大的應(yīng)用價值，但是在體內(nèi)含量較少而且分布廣泛，難以獲得大量高純度的細(xì)胞，限制了該領(lǐng)域的發(fā)展。體外擴(kuò)增輔以免疫磁珠技術(shù)有望解決這一難題。在這一過程中，用免疫磁性微球分離純化出待擴(kuò)增的細(xì)胞，用特定的因子組合培養(yǎng)，許多研究者用這樣的方法尋找擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子組合和移植的最佳時機(jī)。3、免疫檢測免疫磁性微球可以簡單快速地從血液或者骨髓中富集、清除癌細(xì)胞，廣泛地應(yīng)用于疾病檢測、癌癥治療和自身骨髓移植中，還被用于從母體外周血中分離胎兒細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。免疫磁珠分離技術(shù)用在微生物檢測方面能準(zhǔn)確快速地檢測出樣品中的ColiO157，這對于食品衛(wèi)生和預(yù)防疾病的傳播具有重要的意義。PCR技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)結(jié)合在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)等方面有非常重要的作用，這方面的研究在醫(yī)學(xué)檢測方面的應(yīng)用，可以簡便快速地診斷膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮腫瘤細(xì)胞等，使免疫磁性分離技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛。4、在核酸與基因工程上的應(yīng)用免疫磁球可以看作是親合層析技術(shù)中的微型配基裁體，借助親合素-生物素（Biotin-Avidin）系統(tǒng)免疫磁球可與非蛋白質(zhì)結(jié)合，生物素和親合素間有著高度的親和力，兩者的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來越廣泛，與生物磁珠技術(shù)結(jié)合后，更是產(chǎn)生了誘人的發(fā)展前景，并廣泛地應(yīng)用于分離純化RNA、mRNA、核酸片段等及相關(guān)研究。5、用于分型免疫磁珠法可被應(yīng)用于臨床器官移植供受者的快速選配。在高梯度磁場下,用免疫磁珠法分離靜脈或腹腔血中T、B淋巴細(xì)胞，并利用分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行HLA-ⅠⅡ類抗原分型。如采用磁珠技術(shù)和單抗試劑建立起可在1.5h完成HLA-ⅠⅡ類抗原一類分型的新方法，還可應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)進(jìn)行腎移植供受體的HLA分型、探討血液病患者反復(fù)血小板輸注的治療效果與HLA之間的相關(guān)性。6、

用作靶向釋藥系統(tǒng)的載體免疫磁性微球作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細(xì)胞接觸，服用這種制劑后，在體外適當(dāng)部位用一適宜強(qiáng)度的磁鐵，將磁性微球引導(dǎo)到體內(nèi)特定靶區(qū)，提高了殺傷癌細(xì)胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了針對不同癌細(xì)胞的免疫磁性微球，作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體并在實驗中證實這種釋藥載體具有良好的功效。斑點免疫層析、免疫磁分離技術(shù)在E．coli0157：H7檢測中的應(yīng)用1、E．coli0157：H7

是大腸桿菌的其中一個類型，該種病菌常見于牛羊等溫血動物的腸內(nèi)。這一型的大腸桿菌會釋放一種強(qiáng)烈的毒素，并可能導(dǎo)致腸管出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀。已被世界衛(wèi)生組織確定為新發(fā)現(xiàn)的28種傳染病病原體之一,成為各國食品安全和公共衛(wèi)生監(jiān)控的重點。

⑴病征：患者可能出現(xiàn)各種癥狀，包括嚴(yán)重的腹瀉、帶血腹瀉、發(fā)燒、腹絞痛及嘔吐。情況嚴(yán)重時，更可能并發(fā)急性腎病。5歲以下的兒童出現(xiàn)該等并發(fā)癥的風(fēng)險較高。若治療不當(dāng)，可能會致命。

⑵傳播途徑：該種疾病可通過飲用受污染的水或進(jìn)食未熟透的食物(特別是免治牛肉、漢堡扒及烤牛肉)而感染。飲用或進(jìn)食未經(jīng)消毒的奶類、芝士、蔬菜、果汁及乳酪而染病的個案亦有發(fā)現(xiàn)。此外，若個人衛(wèi)生欠佳，亦可能會通過人傳人的途徑，或經(jīng)進(jìn)食受糞便污染的食物而感染該種病菌。

⑶潛伏期：通常為3至4日，但亦會長達(dá)9日。

⑷治理方法：感染大腸桿菌O157:H7的臨床治理方法主要屬支持性治療。若患者出現(xiàn)腹瀉，補(bǔ)充失去的水份及電解質(zhì)十分重要。約50%有腎并發(fā)癥的患者在出現(xiàn)急性癥狀時需要特別治療或輸血。2、斑點免疫層析法（DICA)又稱免疫膠體金標(biāo)記法．是利用免疫色層技術(shù)來檢測樣品中E.ColiO157在E．Coli檢測卡上，將膠體金標(biāo)記的兔抗O157，抗體和兔抗羊IgG抗體分別固定在膜上下，做為測試帶和質(zhì)控帶。樣品增菌液滴加到加樣孔膜上并展開．若含有E.ColiO157就會結(jié)合到檢測帶處形成抗原—抗體復(fù)合物而星現(xiàn)可見的紅色帶，而羊IgG結(jié)臺到質(zhì)控帶星現(xiàn)紅色，它具有簡便、快速定性作用。3、檢驗方法⑴mEC增菌培養(yǎng)取樣品5g接種到50ml10％新生霉索mEC增菌液中搖勻放恒溫?fù)u床，37℃振蕩培養(yǎng)6h。⑵DICA法用試劑盒所配專用棉拭子，沾取樣品增菌液后，插入EHE．Coli檢測卡一端的加樣孔中，10min內(nèi)讀取結(jié)果；只有質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色條帶表明無E．ColiO157抗原存在．同時也表示實驗正確；出現(xiàn)兩條紅色條帶(測試和質(zhì)控帶)表示可能有E．ColiO157抗原存在,如均無出現(xiàn)紅色條帶，表示實驗失敗。

⑶IMS法將樣品增菌液分成DICA法陽性和陰性兩組．均取1ml加入1.5mlep離心管中(離心管事先已加入20μl免疫磁珠)振搖20～30min，上磁鐵板吸附沉淀免疫磁珠，吸去上清液，反復(fù)用PBT-T洗滌2次，加50μlPBs-T重懸浮、混勻，分涂于2塊CT-SMAC平板37℃培