RGQ安裝時(shí)應(yīng)用培訓(xùn)

TheRotor-GeneQ應(yīng)用培訓(xùn)5種型號(hào)，滿足不同的需要Rotor-GeneQ2Plex Rotor-GeneQ2PlexHRM Rotor-GeneQ5Plex Rotor-GeneQ5PlexHRM Rotor-GeneQ6Plex

產(chǎn)品概況工作過程旋轉(zhuǎn)模式

儀器運(yùn)行時(shí)轉(zhuǎn)盤速度

400RPM(加熱和冷卻)

高速數(shù)據(jù)收集

樣品旋轉(zhuǎn)一次，數(shù)據(jù)收集一次

(0.15sec)

重力作用讓試劑都在管底

除去氣泡和濃縮

組分不會(huì)形成沉淀持續(xù)運(yùn)動(dòng)保證無差異

孔與孔間的溫度和光學(xué)400

RPM>10

G離心式鼓風(fēng)機(jī)混勻腔體內(nèi)的空氣腔體門關(guān)上，密封腔體內(nèi)的空氣轉(zhuǎn)盤上的孔能讓空氣自由通過升溫加熱開空氣進(jìn)離心式鼓風(fēng)機(jī)把空氣吸入腔體內(nèi)腔體門打開，排出熱空氣加熱關(guān)轉(zhuǎn)盤上的孔能讓空氣自由通過降溫

離心式鼓風(fēng)機(jī)混勻腔體內(nèi)的空氣光學(xué)通路光學(xué)通路激發(fā)光發(fā)射光PCR轉(zhuǎn)子和PCR管類型136孔轉(zhuǎn)子-適用

0.2ml平蓋PCR管推薦反應(yīng)體積20–50μL72孔轉(zhuǎn)子

-適用0.1mlPCR連管推薦反應(yīng)體積10–50μL

#981005；#981008#981103；#981106轉(zhuǎn)盤72

-72個(gè)樣品Rotor-Disc72，管容積50μL推薦反應(yīng)體積20–25μL

需要密封膜和加熱器轉(zhuǎn)盤100

-100個(gè)樣品Rotor-Disc100，管容積30

μL推薦反應(yīng)體積15–25μL需要密封膜和加熱器加熱器，#9019725Rotor-Disc72，#

981301Rotor-Disc100，#

981311密封膜，#981601PCR轉(zhuǎn)子和PCR管類型2加熱器用來密封

Rotor-Disc密封后不能取下工作流程預(yù)熱取下膜中間的封紙把膜放在

Rotor-Disc正上方放進(jìn)入加熱器中，拉下壓桿等警報(bào)音響，從加熱器中取出注意–至少放置10秒冷卻把膜多余的部分撕走小心地從加熱板上取下Rotor-Disck開始……點(diǎn)擊此圖標(biāo)運(yùn)行設(shè)置運(yùn)行設(shè)置

-QuickStart模式選擇模板運(yùn)行設(shè)置

-QuickStart模式選擇轉(zhuǎn)子運(yùn)行設(shè)置

-QuickStart模式確定步驟之——Hold運(yùn)行設(shè)置

-QuickStart模式確定步驟之——Cycling運(yùn)行設(shè)置

-QuickStart模式確定步驟之——Cycling關(guān)于Acquiring運(yùn)行設(shè)置

-QuickStart模式確定步驟之——Cycling關(guān)于Acquiring運(yùn)行設(shè)置

-QuickStart模式確定步驟之——Melt選做運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式選擇模板運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式選擇轉(zhuǎn)子運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式輸入信息運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式步驟和檢測(cè)設(shè)置運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式步驟和檢測(cè)設(shè)置之確定步驟與QuickStart模式的確定步驟同運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式步驟和檢測(cè)設(shè)置之GainOptimisation運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式步驟和檢測(cè)設(shè)置之GainOptimisation運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式Channel–

設(shè)置需要的數(shù)據(jù)收集通道，如果設(shè)置了多個(gè)通道，確定后有后續(xù)的相應(yīng)通道的對(duì)話框彈出。TubePosition–

保證所選的位置是能夠反應(yīng)并發(fā)熒光的(一般是標(biāo)準(zhǔn)品)。TargetSampleRange–

與所用的檢測(cè)化合物有關(guān)：

嵌入式染料(Intercalatingdyes

)應(yīng)設(shè)置為1-3Fl單位；

探針染料(Probes)一般應(yīng)設(shè)置為

5-10Fl單位； QuenchedFRET

檢測(cè)應(yīng)設(shè)置為70-80Fl

單位，因?yàn)殡S著反應(yīng)進(jìn)行其熒光值將降低

。AcceptableGainRange–

應(yīng)為默認(rèn)的

-10to+10步驟和檢測(cè)設(shè)置之GainOptimisation運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式步驟和檢測(cè)設(shè)置之GainOptimisation運(yùn)行設(shè)置

-

Advanced

模式設(shè)置完成關(guān)于Longrange:在到達(dá)設(shè)置的循環(huán)數(shù)后，每一循環(huán)該步驟（一般設(shè)置變性階段）都增加1秒。關(guān)于Touchdown:在到達(dá)設(shè)置的循環(huán)數(shù)后，每一循環(huán)的該步驟（一般設(shè)置退火階段）都降低1℃。Melt:從一個(gè)較低溫度升到一個(gè)較高溫度，溶劑的特性，與核酸的特有屬性。HRM:HighResolutionMelt，高分辨率的熔解曲線，只有在裝了HRM硬件的儀器上才能運(yùn)用。運(yùn)行設(shè)置

-

額外設(shè)置1關(guān)于OpticalDenaturationCycling:用熒光強(qiáng)度來判斷變性是否完成運(yùn)行設(shè)置

-

額外設(shè)置2運(yùn)行設(shè)置補(bǔ)充說明-

DataAcquisition設(shè)置運(yùn)行程序時(shí)要設(shè)置數(shù)據(jù)采集點(diǎn)數(shù)據(jù)采集點(diǎn)可以在任何的一個(gè)步驟的終結(jié)時(shí)，并以藍(lán)色的點(diǎn)作標(biāo)記?？梢酝ㄟ^點(diǎn)擊“Acquiring”作數(shù)據(jù)收集的設(shè)置。從列表中選擇需要的數(shù)據(jù)收集通道，可以選擇多通道。點(diǎn)擊“DyeChart”可觀測(cè)數(shù)據(jù)收集通道的信息，包括激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)，可以應(yīng)用的染料或顯色劑。在程序的任何或所有步驟都能設(shè)數(shù)據(jù)收集點(diǎn)。當(dāng)數(shù)據(jù)曲線飽和，會(huì)在縱坐標(biāo)100處形成橫線。設(shè)置和調(diào)整Gain值1設(shè)置Gain值，讓所有收集到的數(shù)據(jù)都在檢測(cè)器(PMT)能檢測(cè)的范圍內(nèi)

如果Gain值：

過低

→信號(hào)會(huì)因埋沒在在本底噪聲內(nèi)而漏掉；

過高→信號(hào)會(huì)超出范圍(飽和).

如果熔解曲線中，開始的一段時(shí)間縱坐標(biāo)100處形成橫線，熔解曲線應(yīng)用較低的Gain設(shè)置來收集數(shù)據(jù)，但無需再重復(fù)做擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)際數(shù)據(jù)的不會(huì)因Gain值設(shè)置而改變，Gain值設(shè)置改變了也能反映實(shí)際的數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)。每個(gè)數(shù)據(jù)采集通道的Gain值范圍是

-10~10：-10為最低的敏感度；+10最高敏感度。

0481026-2-4-6-8-1024816326412825651210242048Gain值設(shè)置每增加1，對(duì)PMT的輸入電壓約能增加2倍，這樣對(duì)熒光檢測(cè)的敏感度能增加2倍。Gain值的設(shè)置不可能每次都適用，最好能在hold階段根據(jù)實(shí)驗(yàn)的奔底而做出改變。使用Auto-Gain設(shè)置能自動(dòng)檢測(cè)反應(yīng)初始時(shí)的熒光強(qiáng)度，設(shè)定出合適的Gain值。當(dāng)使用Auto-Gain設(shè)置時(shí)，在運(yùn)行初始會(huì)出現(xiàn)該界面。設(shè)置和調(diào)整Gain值2編輯樣品1.命名樣品2.選擇樣品的“Type”：UnknownNoneNTCStandardPositivecontrolNegativecontrolCalibrator4.Groups–用作統(tǒng)計(jì)分析5.GivenConc.只有type是”Standard”時(shí)可編輯，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.是否選擇–

Selected6.Color用于顏色區(qū)分圖表中不同的樣品。綜述:AbsoluteQuantificationofmRNAusingrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreactionassaysSABustinJ.Mol.Endo200025,169-193標(biāo)準(zhǔn)曲線通過已知濃度的cDNA/RNA建立關(guān)鍵因素: -DNA/RNA片段要純，單一片段 -移液準(zhǔn)確 -標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋準(zhǔn)確，平行性好

絕對(duì)定量絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由5個(gè)或以上已知濃度樣品而確定。一般每個(gè)濃度的樣品做3個(gè)重復(fù)。如果每個(gè)梯度相差10倍，最理想的狀態(tài)是，PCR的效率足夠高到達(dá)2，預(yù)期Ct值能相差3.162。3.162是10的平方根。未知濃度的目標(biāo)樣品，其濃度和熒光值的變化規(guī)律與標(biāo)準(zhǔn)曲線一致。5,00050,000500,0005,000,00050,000,000500,000,000CTamount1.曲線上的Ct與濃度的log關(guān)系2.標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)效率反應(yīng)效率與斜率(m)相關(guān)E=10(-1/m)–1E=1=100%.4.判定系數(shù)(R2)表示假設(shè)值與真實(shí)值的相關(guān)性，

越接近1相關(guān)性越好。絕對(duì)定量與反應(yīng)效率

絕對(duì)定量絕對(duì)定量AbsoluteQuantitation絕對(duì)定量絕對(duì)定量的準(zhǔn)確性完全決定于標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)確性絕對(duì)定量參考文獻(xiàn):AbsoluteQuantificationofmRNAusingrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreactionassaysSABustinJ.Mol.Endo200025,169-193標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的cDNA/RNA構(gòu)建關(guān)鍵因素: -DNA/RNA一定是純的，只有一種片段的 -移液準(zhǔn)確 -稀釋準(zhǔn)確平行性好

-未知濃度的樣品的點(diǎn)能落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上絕對(duì)定量相對(duì)定量Analysis>Quantitation>CyclingAGreen>Show>OK>Threshold>手動(dòng)調(diào)閾值，得出Ct值熔解的特性是不同核酸的固有特性一般是用嵌入式染料分析PCR產(chǎn)物，加熱熔解——從雙鏈到單鏈不同的片段（如堿基序列不同，GC含量不同）有不同的熔解特性HRM十分敏感，能夠區(qū)分一個(gè)堿基改變而引起的差別

(e.g.SNPs)HRM比較熔解曲線的型狀和溫度來區(qū)分不同樣品的特性HRM原理雙鏈產(chǎn)物單鏈產(chǎn)物HRM試劑嵌入式染料的熒光隨著雙鏈的解開而降低，其熒光強(qiáng)度與解鏈的特性相關(guān)高精度的溫度控制和光學(xué)數(shù)據(jù)收集，能得到十分詳細(xì)和分辨率高的數(shù)據(jù)。HRM工作流程擴(kuò)增設(shè)置正常的PCR步驟和HRM步驟，用嵌入式染料

(e.gSYTO9)每個(gè)基因型都應(yīng)設(shè)置Control(eg.已確定的wild-type,heterozygote,variant樣品)

檢測(cè)擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增效率 (擴(kuò)增不好，HRM的結(jié)果也不好)HRM分析運(yùn)行HRM分析指定controls觀測(cè)結(jié)果HRM運(yùn)行設(shè)置HRM分析HRM分析儀器的維護(hù)保養(yǎng)1.光學(xué)檢測(cè)鏡頭定期清潔，棉簽蘸酒精擦拭光學(xué)檢測(cè)鏡頭。2.保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)清潔防止雜物進(jìn)入，保證降溫效果，應(yīng)保持儀器附近區(qū)域的清潔，特別是儀器底部紙屑、毛發(fā)等雜物。3.常保持儀器蓋關(guān)閉4.腔體污染后的清潔先用物屑紙巾蘸0.1%的次氯酸鈉溶液擦拭腔體，然后用PCR級(jí)的水清潔干凈。問題解決OnlineHelp文件：Help>Contents(或在NewRun對(duì)話框