第六章酶類生化產(chǎn)品制備技術(shù)

生化工藝學(xué)課件

第六章酶類生化產(chǎn)品制備技術(shù)第六章酶類生化產(chǎn)品制備技術(shù)§6.1概述§6.2酶的組成及分類§6.3酶的應(yīng)用§6.4酶類生化產(chǎn)品的分離純化方法§6.5木瓜蛋白酶的提取§6.6凝血酶的制備§6.7尿激酶的提取§6.8人尿激肽釋放酶的提取、§6.9糜蛋白酶的提取、§6.10細(xì)胞色素c的提取§6.11超氧化物歧化酶的制備§6.1概述世界酶制劑廠著名公司：丹麥Novo公司、荷蘭的Gist-Brocades公司、美國的國際Genencor公司、芬蘭的Alko公司、德國的BayerAG公司、芬蘭的Aultor公司、日本的天野制藥和長瀨產(chǎn)業(yè)等歐洲在酶工程領(lǐng)域的研究項目主要集中于脂肪酶和磷脂酶的生產(chǎn)和利用、高溫菌中多糖類物質(zhì)的生產(chǎn)、酶法生產(chǎn)中間體、與酶生產(chǎn)相關(guān)的微生物基因組的研究我國酶制劑生產(chǎn)企業(yè)上百家，僅占世界總份額2％左右工業(yè)用酶制劑：工業(yè)酶制劑的來源及特點已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種，工業(yè)常用酶僅有數(shù)十種，目前大量生產(chǎn)的僅有十余種80％以上的工業(yè)酶為水解酶，用于降解自然界中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等高聚物→淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶大多數(shù)酶是從微生物中獲得的目前嗜極菌極端酶在酶制劑工業(yè)中迅速發(fā)展，第一個極端酶？（應(yīng)用于PCR技術(shù)）酶制劑的等級工業(yè)級、食品級、醫(yī)藥級食品級與醫(yī)藥級酶制劑純度要求嚴(yán)格，且要進(jìn)行產(chǎn)品毒性和安全性的評價，新型微生物在食品和醫(yī)藥界的應(yīng)用，須得到法定機(jī)構(gòu)的安全性確認(rèn)→大多食品工業(yè)微生物的生產(chǎn)僅限于11種真菌、8種細(xì)菌、4種酵母菌在識別與出售時，酶的指標(biāo)為催化活力，而非重量→儲存時生物活性與穩(wěn)定性非常重要一般而言，含雜蛋白的酶制劑比純品穩(wěn)定，干燥品比液體制劑穩(wěn)定酶制劑品種的開發(fā)1）食品加工用酶：生產(chǎn)低聚糖的酶，如葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、（低聚異麥芽糖）、β-果糖基果糖轉(zhuǎn)移酶（乳果糖）以及環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)修飾，以得到α、

β、γ環(huán)狀糊精2）飼料用酶：NSP酶、植酸酶等3）紡織及洗滌劑用酶：eg.原果膠酶，既可除去對皮膚有刺痛作用的原果膠質(zhì)，又可提高染色性；堿性絲氨酸型蛋白酶、堿性脂肪酶、堿性纖維素酶和淀粉酶現(xiàn)已擴(kuò)展到潔具、廚具相關(guān)領(lǐng)域4）臨床診斷、治療用酶、化妝品用酶：風(fēng)險較大，但成功后效益較高§6.2酶的組成及分類按酶的組成分類按酶所催化反應(yīng)的類型分類按其功效和臨床作用分類：消化酶：胰酶、胰酯酶、胃蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶等抗炎、黏痰溶解酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、膠原酶、超氧化物歧化酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、核糖核酸酶等抗凝或止血酶：鏈激、尿激酶纖溶酶等；凝血酶、促凝血酶原激酶。§6.3酶的應(yīng)用助消化酶類生化產(chǎn)品：補(bǔ)充內(nèi)源消化酶的不足，促進(jìn)食物中各類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、治療消化器管疾病及各種原因引起的食欲不振、消化不良，如胃蛋白酶、胰酶、凝乳酶、纖維素酶和麥芽糖淀粉酶等——多酶片消炎酶類生化產(chǎn)品：蛋白酶作為抗炎劑；溶解黏痰作用酶心血管疾病治療酶類生化產(chǎn)品：彈性蛋白酶、激肽釋放酶、溶栓酶、凝血酶抗腫瘤酶類生化產(chǎn)品：L-天冬酰胺酶治療淋巴肉瘤和白血病；谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、組氨酸酶、酪氨酸氧化酶5、其它酶類生化產(chǎn)品：SOD、PEG-腺苷脫氫酶、DNA酶、RNA酶、細(xì)胞色素c、青霉素酶等6、輔酶類生化產(chǎn)品：NAD、NADP、FMN、FAD、泛醌、輔酶A7、臨床診斷酶類生化產(chǎn)品：氧化酶、脫氫酶、激酶、熒光酶，用于測定20多個化驗項目測定某一項目時需要一個或幾個酶的配合，組成一個酶反應(yīng)系統(tǒng)→測定一個最終反應(yīng)產(chǎn)物→酶試劑盒eg.膽固醇氧化酶（鏈霉菌發(fā)酵液）＋膽固醇酯酶（豬胰）測定血清中總膽固醇的酶試劑盒§6.4酶類生化產(chǎn)品的提取分離方法酶的提取分離包括5步：原料的選擇、酶生物原料的預(yù)處理、提取、純化或結(jié)晶利用酶的催化活性作為選擇提純方法和操作條件的指標(biāo)，在提取和純化過程中，應(yīng)隨時測定總活力和比活力→了解每一步的收率和純度→分析和決定下一步工藝的取舍生物細(xì)胞中酶的總量不少，但每一種含量非常小，大都在0.0001%-1%一、酶的原料選擇不同酶的用料選擇：原材料來源豐富，含量較高；不同生長發(fā)育情況及營養(yǎng)狀況：微生物制酶時需測定酶活力來決定取酶階段，動物器官提取酶則與動物年齡及飼養(yǎng)有關(guān)動植物提取酶收到原料的限制，工業(yè)生產(chǎn)的重點已逐漸轉(zhuǎn)向微生物（不受季節(jié)、氣候和地域限制，生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、成本低，能大規(guī)模生產(chǎn)）二、酶的預(yù)處理、提取純化動物組織經(jīng)丙酮迅速脫水制成丙酮粉（冷丙酮低溫處理），低溫儲存數(shù)年；微生物大量保存時可采用干燥法（細(xì)胞自溶、增加酶釋放）一個好的方法應(yīng)該：比活力提高大、總活力回收高、重復(fù)性好；不要重復(fù)同一步驟或同一方法（不但不能去掉不同種類的雜質(zhì)，還會使酶總活力下降）在逐漸純化過程中，隨著雜質(zhì)的去除，蛋白質(zhì)總濃度下降，相互穩(wěn)定性也隨之減弱，酶易于失活酶的純度用比活力來表示，比活力越高，酶純度越高每一操作步驟盡量測定三個指標(biāo)：總蛋白、總活力、比活力，在提純的過程中，上述指標(biāo)的變化趨勢如何？酶的純度鑒定一般采用電泳法或HPLC法純化倍數(shù)、產(chǎn)量的定義三、酶的純度與產(chǎn)量§6.5木瓜蛋白酶的提取由植物番木瓜葉精制而得得蛋白酶混合物——一種巰基蛋白酶，專一性差，能分解比胰蛋白酶更多的蛋白質(zhì)EDTA、半胱氨酸、亞硫酸鹽為激活劑，等電點9.6能將纖維蛋白溶酶原激活為纖維蛋白溶酶，促進(jìn)傷口愈合，治療水腫木瓜蛋白酶的應(yīng)用1）在啤酒麥汁制造中加入酶，對麥芽的糖化力有明顯的提高，能加快過濾使濾渣較爽。在固態(tài)發(fā)酵的白酒，黃酒，酒曲生產(chǎn)中酶，與酒曲（酒母）和糖化酶，調(diào)勻加入米飯（原料）中，可縮短發(fā)酵時間，提高出酒率和酒精度，酒質(zhì)口感醇和。2）在淀粉漿中加入酶，水解2小時，可降低淀粉的蛋白質(zhì)含量。整?；蚱扑榈挠衩琢Ｃ繃嵓?00-500克酶浸泡24小時，提高淀粉收得率，減少淀粉中的蛋白質(zhì)含量。3）茶葉加工的應(yīng)用：噴灑在茶葉上，拌勻后揉制發(fā)酵?？煽s短發(fā)酵時間15-20分鐘，茶湯色明亮，香氣和口感更好，茶垢減少。4）制煙中的應(yīng)用：卷煙生產(chǎn)中兌水稀釋噴灑，可使煙的香味醇厚，刺辣味減少，提高煙葉等級。木瓜乳汁粗制上清液（木瓜凝乳酶）木瓜蛋白酶粗品精制工藝一木瓜蛋白酶的精制提取工藝鹽析濾液（棄去）蛋白酶結(jié)晶精制不溶物（棄去）濾液加入激活劑、離心或過濾除不溶物，pH9.0做(NH4)2SO4飽和度實驗45％(NH4)2SO4沉淀上清液（棄去）沉淀pH9.0做(NH4)2SO4飽和度實驗，下限去雜，上限沉淀木瓜酶加入激活劑過濾木瓜乳汁提取不溶物（棄去）木瓜蛋白酶濾液精制工藝二精制上清液（棄去）沉淀產(chǎn)品干燥0.03M半胱氨酸，pH6.5NaCl鹽析實驗一、體內(nèi)的凝血過程凝血過程包括三個基本的生化反應(yīng)：①凝血酶原激活物的形成；②凝血酶原激活物在鈣離子的參與下使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪福虎劭扇苄缘睦w維蛋白原在凝血酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白。凝血機(jī)制的研究，促進(jìn)了對許多出血性疾病的認(rèn)識，如血友病的成因，主要是由于血漿中缺乏凝血因子Ⅷ。凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ都在肝臟中合成，在它們形成過程中需要維生素K參與。缺乏維生素K，將會出現(xiàn)出血傾向?！?.6凝血酶的制備凝血機(jī)制血液凝固性球蛋白，人血清中幾乎不存在，而在牛血清中則含有這種球蛋白分子量66kDa的糖蛋白，單鏈，在凝血酶原激活因子催化下，Arg274-Thr275和Arg323-Ile324斷裂，釋放出274個a.a，產(chǎn)生活性凝血酶，A鏈49a.a，B鏈259a.a在實驗室或臨床工作中，可按需要針對凝血過程中的各個環(huán)節(jié)，采取不同措施，達(dá)到延緩凝血或有效止血的目的。手術(shù)后為防止出血，可在手術(shù)部位施加凝血酶、纖維蛋白等凝血物質(zhì)，還可用溫?zé)岬募啿?、棉花或明膠海綿按壓傷口促凝止血。血液凝固或血凝是指血液由流動的液體狀態(tài)轉(zhuǎn)變成不能流動的膠凍狀的過程。血液凝固后1～2小時，血凝塊會發(fā)生回縮，并釋出淡黃色的液體，稱為血清。血清與血漿的區(qū)別？前者缺乏參與凝血過程被消耗掉的一些凝血因子和纖維蛋白，但增添了少量血液凝固時由血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板釋放出來的化學(xué)物質(zhì)，人體中血清不可以再凝。二、臨床或?qū)嶒炛械闹寡h(huán)節(jié)§6.7尿激酶的提?。╱rokinase）蛋白水解酶→血纖維蛋白溶酶原→血纖維蛋白溶酶堿性蛋白酶，由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動物尿中，臨床的主要應(yīng)用是溶血栓、抗凝血作用（還可降血壓？）日本采用親和層析，收率較高；美國采用人胎兒腎細(xì)胞培養(yǎng)，近年來將尿激酶的基因成功地轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中得到表達(dá)。尿中含量很低→關(guān)鍵選擇合適的吸附劑采用硅藻土或樹脂吸附法尿激酶活性測定纖維素平板法：瓊脂糖＋纖維蛋白原＋凝血酶→凝結(jié)成為纖維膜→加入不同濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品→37oC培養(yǎng)箱中保溫18h→測量每個溶圈垂直的直徑待測樣品應(yīng)與