第一章 分子生物學的基本操作

第一章分子生物學的基本操作分子生物學研究從20世紀中葉開始高速發(fā)展的最主要原因——現(xiàn)代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術的進步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達?；蚬こ碳夹g區(qū)別于其它技術的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力。技術保證1——DNA的核苷酸序列分析技術DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學和生物化學的基礎上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術學，這門技術，對于從分子水平上研究基因的結構與功能的關系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。1.1重組DNA操作的兩大技術保證知識回顧——核酸的化學組成核酸（RNA、DNA）核苷酸磷酸核苷戊糖堿基核糖（RNA）脫氧核糖（DNA）A、G、C、UA、G、C、T戊糖堿

基腺嘌呤鳥嘌呤嘌呤嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶核苷如果是存在于DNA中的脫氧核苷則2’位則是H而不是OH。磷酸+戊糖+堿基=核苷酸核苷酸的連接方式核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。技術保證2——DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上（載體上），并轉入寄主細胞中進行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。1.2細菌轉化分子克隆的載體----具備自主復制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質粒等小分子量復制子都可以作為基因導入的載體。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細胞經適量氯化鈣處理后，能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報道，經氯化鈣處理的大腸桿菌細胞同樣能夠攝取質粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies1.將快速生長中的大腸桿菌置于經低溫（0℃）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質球）。感受態(tài)細胞制備及細菌轉化步驟：處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉化基因實現(xiàn)表達、細胞活性恢復。3.立即將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。2.Ca2+與轉化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。5.涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉化子。1.3基因擴增聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。基本原理

PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由高溫變性—低溫退火—適溫延伸三個基本反應步驟構成，經多個循環(huán)，理論上靶DNA分子將呈現(xiàn)指數(shù)性擴增。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的互補

鏈。Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR儀1.4

核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視。

基本原理

一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子同介質的摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點樣電泳檢測結果檢測:溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr）染色，紫外觀察。在紫外線的照射下結合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。1.5

基因工程載體

1.至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。

2.

至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。

3.

至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞

4.安全性大腸桿菌載體pBR322結構圖

載體特點基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜其進入適當宿主細胞且能自主復制的DNA分子。1.5.1

質粒DNA及其分離細菌質粒是存在于細胞質中的一類獨立于染色體并能自主復制的遺傳成份。絕大多數(shù)的質粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復制子，也有線性質粒的報道。質粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

E．coli的質粒種類

1)colE1因子（大腸桿菌素因子）—多數(shù)不能進行接合轉移DNA，屬高拷貝松弛型。

2)R因子（抗藥性因子）

可接合轉移DNA，屬低拷貝嚴緊型，質粒較大，操作不便

3)F因子（性因子）質粒載體DNA的分離——堿裂解法堿裂解法是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的的。在pH大于12的堿性條件下染色體DNA的氫鍵斷裂雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當pH恢復至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型保存在溶液中。而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過離心染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質粒DNA。1.5.2

重要的大腸桿菌質粒載體1.5.2.1.

pSC101質粒載體pSC101是一種嚴緊型復制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質粒載體，平均每個寄主細胞僅有1～2個拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr）。

pSC101質粒不僅具有可插入外源DNA的多個限制性核酸內切酶的單克隆位點，而且還具有四環(huán)素抗性的強選擇記號，因此，它被選為第一個真核基因的克隆載體。當然，這個質粒載體也有其明顯的缺點，它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質粒，從帶有該質粒的寄主細胞中提取pSC101DNA，其產量就要比其它質粒載體低得多。1.5.2.2.

ColE1質粒載體

ColE1質粒屬于松弛型復制控制的多拷貝質粒。在正常生長條件下，當培養(yǎng)基中用于蛋白質合成的氨基酸被耗盡，或是在對數(shù)生長末期的細胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停止。此時，松弛型復制控制的質粒DNA仍然可以繼續(xù)進行復制達數(shù)小時之久，使每個寄主細胞中所累積的ColE1質?？截悢?shù)增加到1000~3000個之多，質粒DNA大約可占細胞總DNA的50%左右。由此可見，由于質?？截悢?shù)高，插入的外源DNA片段的產量也就得到相應的提高。

1.5.2.3

pBR322質粒載體pBR322質粒是由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質粒、轉座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來源于pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）。123第一個優(yōu)點：分子量較小，易于純化，操作便利。第二個優(yōu)點：具有兩種抗生素抗性基因以用作轉化子的選擇記號。質粒DNA編碼的抗生素抗性基因的插入失活效應，是檢測重組體質粒的一種十分有用的方法。第三個優(yōu)點：具較高的拷貝數(shù)，若經過氯霉素擴增，每個細胞中可累積1000~3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。pBR322質粒載體的優(yōu)點思考題使用pBR322載體進行基因克隆易于造成載體自身連接環(huán)化,為什么?1.5.2.4

pUC質粒載體pUC系列質粒載體包括如下四個部分：(i)來自pBR322質粒的復制起點（ori）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr），但它的核苷酸序列已經發(fā)生了變化，不再含有原來的限制性核酸內切