自學(xué)自講(基因敲除)

基因敲除技術(shù)及其應(yīng)用Contents基因敲除的步驟及方法2基因敲除的定義1基因敲除的應(yīng)用34Subtitle基因敲除的定義

基因敲除(Geneknockout)是指一種遺傳工程技術(shù)，針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進(jìn)一步對(duì)生物體造成影響，進(jìn)而推測(cè)出該基因的生物學(xué)功能?；蚯贸幕静襟E

第一步：ES細(xì)胞的獲得第二步：重組載體的構(gòu)建

第三步：重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)

第四步：目的細(xì)胞的篩選

第五步：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得基因敲除的方法一．Cre-LoxP系統(tǒng)Cre-LoxP系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體,但是具有了時(shí)空調(diào)控的功能。它由Cre重組酶和LoxP位點(diǎn)兩部分組成。Cre-LoxP系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的不同發(fā)育階段、不同組織類型中特異性的刪除,可以消除由于基因位置改變?cè)斐傻挠绊?加強(qiáng)了對(duì)基因的控制能力,使研究者可以更方便地有針對(duì)性地進(jìn)行目標(biāo)階段的研究工作;Cre-LoxP系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)染色體間的基因重排;但同時(shí)也可以看出該系統(tǒng)對(duì)基因的了解要求極高,并且對(duì)基因片段的操作能力要求也很高,基因片段的大小通常在10kb以上,這些都不利于研究工作進(jìn)行。基因敲除的方法二．轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)

轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)自從20世紀(jì)50年代被McClintock發(fā)現(xiàn)以來(lái),已經(jīng)成為許多組織器官進(jìn)行基因分析的工具。在人和小鼠的基因組中,轉(zhuǎn)座子衍生序列多達(dá)整個(gè)基因組的40%,這提示在發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)座子有重要作用。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)易于操作,所需時(shí)間短,具有高通量的特點(diǎn),可以攜帶多種抗性標(biāo)記,方便了同時(shí)進(jìn)行多基因功能研究。但其應(yīng)用范圍有限,適用于有一段克隆到的原始基因組序列,長(zhǎng)度在10～15kb,且轉(zhuǎn)座子應(yīng)滿足以下條件:①轉(zhuǎn)座子本身應(yīng)該很短,易于操作,并對(duì)任何期望敲除區(qū)域有高效率;②在刪除目的區(qū)域后應(yīng)留下足夠長(zhǎng)的兩臂用于同源重組。這些都限制了轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用?；蚯贸姆椒ㄈ虿东@載體系統(tǒng)基因捕獲技術(shù)是將突變基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞從而獲得小鼠基因組文庫(kù),進(jìn)行小鼠基因組的功能研究,它屬于大規(guī)模隨機(jī)敲除。典型的基因捕獲載體通常包括一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)道基因,并通過(guò)調(diào)控元件使含有小鼠基因組文庫(kù)的ES克隆很容易被選擇性培養(yǎng)基篩選出來(lái)。基因敲除的方法四．Hit和Run法Hit和Run法也稱進(jìn)退策略。它包括兩次同源重組:第一步(Hit)用插入型載體進(jìn)行同源重組,在靶位點(diǎn)插入帶有突變的基因組序列以及帶有兩個(gè)篩選標(biāo)記(如neo和tk)的載體序列;第二步(Run)利用tk抗性篩選,富集發(fā)生去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序列的回復(fù)突變的克隆。Hit和Run法的不足之處是:①無(wú)法精確控制染色體內(nèi)的同源重組,可能會(huì)失去攜帶突變的同源序列,而保留未修飾的內(nèi)源片段;②整個(gè)過(guò)程需要采用兩種培養(yǎng)基分別進(jìn)行先后兩次篩選;③無(wú)法同時(shí)引進(jìn)多個(gè)位點(diǎn)突變。基因敲除的方法五.雙置換法雙置換法也屬于精細(xì)突變敲除。它首先用含有Hprt基因的打靶載體轉(zhuǎn)染Hprt-ES細(xì)胞,通過(guò)在次黃嘌呤、氨喋呤和脫氧胸腺嘧啶苷培養(yǎng)基中篩選并用PCR進(jìn)行基因組分析,篩選發(fā)生同源重組、Hprt基因陽(yáng)性克隆。然后用只攜帶突變同源序列的打靶載體轉(zhuǎn)染上一步獲得的Hprt+ES細(xì)胞。同源重組發(fā)生后,突變序列將Hprt置換出來(lái)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于,第一步獲得的Hprt+ES細(xì)胞,除了可用于產(chǎn)生普通的基因剔除小鼠外,也可以作為將不同突變引入靶基因的基礎(chǔ)?；蚯贸难芯亢蛻?yīng)用1.1在人類疾病動(dòng)物模型方面的應(yīng)用1.2基因和蛋白功能研究方面的應(yīng)用1.3藥物依賴性研究方面的應(yīng)用1.4毒理學(xué)研究方面的應(yīng)用1.5免疫學(xué)方面的應(yīng)用1.5免疫學(xué)方面的應(yīng)用1.6治療措施研究方面的應(yīng)用

在人類疾病研究方面的應(yīng)用人類幾乎所有的疾病都與基因有關(guān),基因敲除動(dòng)物模型的建立,為研究人類疾病提供了一個(gè)嶄新方法,尤其是遺傳性疾病。OA1(眼球白化癥,ocularalbinism)是一種基因紊亂遺傳性疾病,能引起視力嚴(yán)重下降,斜視、光恐怖、眼球震顫。Incerti[3]通過(guò)敲除法去除小鼠OA1基因,眼科檢查顯示眼球底部黑色素不足,臨床癥狀表現(xiàn)與人的相似,從而用來(lái)研究OA1的發(fā)病機(jī)制。在基因和蛋白功能研究方面的應(yīng)用klotho(kl)基因是Matsumura等在研究自發(fā)型高血壓時(shí)發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因[7]。kl基因主要在腎臟和腦表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物有膜結(jié)合型和分泌型兩種蛋白異構(gòu)體形式,二者可能分別是膜結(jié)合受體和體液調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白。kl基因敲除小鼠過(guò)早出現(xiàn)和人類衰老相關(guān)的多種行為和病理生理改變,如壽命縮短、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、性功能障礙、癡呆、白內(nèi)障、動(dòng)脈粥樣硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松、免疫功能降低等[8]。藥物依賴性研究方面的應(yīng)用利用基因敲除技術(shù)可以選擇性敲除某一特定受體基因,獲得先天缺失該受體基因的動(dòng)物,通過(guò)比較基因缺失動(dòng)物和野生型動(dòng)物在依賴性模型上的行為差別,可以準(zhǔn)確判斷該受體所發(fā)揮的作用。阿片受體是阿片類物質(zhì)直接作用的受體,不僅在介導(dǎo)阿片類鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用,而且也與精神活性藥物的依賴性有關(guān)。毒理學(xué)研究方面的應(yīng)用金屬硫蛋白(MT)是細(xì)胞內(nèi)富含半胱氨酸巰基(SH)的小分子蛋白,目前認(rèn)為MT具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鋅和銅等功能性金屬離子的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、拮抗有害重金屬毒性、捕獲自由基、抗過(guò)氧化應(yīng)激、抗凋亡和參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等功能[17]。利用MT基因敲除小鼠還可進(jìn)一步觀察多環(huán)芳烴化合物免疫毒性機(jī)制與MT之間的關(guān)系。另有研究選用MT基因敲除小鼠和野生型小鼠對(duì)DMBA的免疫毒性反應(yīng)進(jìn)行了觀察比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMBA對(duì)MT基因敲除的動(dòng)物所造成的免疫損傷比含有MT的動(dòng)物要明顯嚴(yán)重,提示MT對(duì)DMBA的免疫毒性具有明顯的保護(hù)作用。免疫學(xué)方面的應(yīng)用近年來(lái),在免疫學(xué)方面出現(xiàn)了幾十種免疫分子基因敲除動(dòng)物模型,將免疫學(xué)研究特別是免疫耐受的研究推到一個(gè)新的階段。例如:TCR基因敲除后,小鼠胸腺發(fā)育不全,脾中B細(xì)胞增多;免疫球蛋白u(yù)鏈基因被敲除后,B細(xì)胞發(fā)育受阻;MHCI和II類抗原基因敲除后,小鼠缺乏CD4+、CD8+型T細(xì)胞;β2微球蛋白基因敲除后缺乏CD4+、CD8+型T細(xì)胞;RAG重組酶基因被敲除后,出現(xiàn)免疫球蛋白重排障礙等[18]。

治療措施研究方面的應(yīng)用載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠是目前在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)治療研究領(lǐng)域中應(yīng)用最多的基因工程動(dòng)物。若干研究表明,通過(guò)正常體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移治療,可以延緩ApoE基因敲除小鼠AS病變的發(fā)展。內(nèi)抑素是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的有效的血管新生抑制劑,Moulton和Kruger[19,20]發(fā)現(xiàn)通過(guò)大劑量持續(xù)注射內(nèi)抑素全組蛋白能夠有效的抑制ApoE基因敲除鼠AS斑塊的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)證明,將正常小

治療措施研究方面的應(yīng)用鼠的骨髓移植到ApoE基因敲除小鼠后,其血清中即可發(fā)現(xiàn)ApoE,而血漿清除脂蛋白的能力明顯增強(qiáng),血清膽固醇亦達(dá)到正常水平。故認(rèn)為骨髓移植是防止飲食所致小鼠AS的有效措施。

治療措施研究方面的應(yīng)用人類器官移植在人類疾病治療中起舉足輕重的作用,但有兩大問(wèn)題一直未得到解決:一是器官來(lái)源,目前器官來(lái)源主要是尸體,受到時(shí)間和運(yùn)輸?shù)葪l件的限制,在有些地方還涉及到宗教的問(wèn)題;二是器官移植的免疫排斥反應(yīng)。基因敲除動(dòng)物模型可能會(huì)解決這兩個(gè)難題。Kuwaki等采用基因敲除法,將引起超

治療措施研究方面的應(yīng)用急性排斥反應(yīng)的半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除,用此方法培育的動(dòng)物的器官可以移植到人體而無(wú)排斥反應(yīng)。他們已成功培育半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除豬,且已經(jīng)開(kāi)展了將該基因敲除豬的心臟移植至狒狒體內(nèi)的實(shí)驗(yàn),經(jīng)移植后的狒狒存活了2-6個(gè)月(均值為78天),且均未出現(xiàn)超急性排斥反應(yīng)的表現(xiàn)。參考文獻(xiàn)[1]陳系古,都同功.基因打靶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志.1997,7:47-50.[2]黃冰,黃文革,陳系古,等.小鼠胚胎干細(xì)胞在六種培養(yǎng)體系的培養(yǎng)觀察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2000,8:1-6.[3]IncertiB,CorteseK,PizzigoniA,etal.Oa1knock-out:newinsightsonthepathogenesisofocularalbinismtype1[J].HumMolGenet.2000,9(19):2781-2788.[4]WittingPK,PetterssonK,Ostlund-LindqvistAM,etal.InhibitionbyacoantioxidantofaorticlipoproteinlipidperoxidationandatherosclerosisinapolipoproteinEandlowdensitylipoproteinreceptorgenedoubleknockoutmice[J].FASEBJ.1999,13(6):667-75.參考文獻(xiàn)[5]LehesteJR,MelsenF,WellnerM,etal.Hypocalcemiaandosteopathyinmicewithkidney-specificmegalingenedefect[J].FASEBJ.2003,17(2):247-249.[6]KisanukiYY,HammerRE,MiyazakiJ,etal.Tie2-Cretransgenicmice:Anewmodelforendothelialcell-lineageanalysisinvivo[J].DevBiol.2001,230(2):230-242.[7]UtsugiT,OhnoT,OhyamaY,etal.Decreasedinsulinproductionandincreasedinsulinsensitivityintheklothomutantmouse,anovelanimal