實驗生物顯微制片技術(shù)

實驗生物顯微制片技術(shù)第一頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康呐c要求1.理解石蠟切片法各主要步驟的基本原理。2.掌握各種試劑的配制和各種器材的使用方法。3.掌握石蠟切片法的具體操作方法。4.熟悉實驗過程中應(yīng)注意的事項。5.自己取材，植物、動物材料制備標(biāo)本片。6.通過在顯微鏡下觀察魚肝細(xì)胞染色玻片標(biāo)本，了解魚肝細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)。第二頁，共二十二頁，2022年，8月28日生物制片技術(shù)概述生物顯微制片技術(shù)是觀察研究細(xì)胞、組織、胚胎、動物等的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及病理變化的重要方法。由于生活時的生物體器官組織過大或過厚不能在光學(xué)顯微鏡下觀察，或者能放在光學(xué)顯微鏡下，光線也不能透過，而且一些微細(xì)結(jié)構(gòu)的折光率相同，即使光線能夠透過也看不清楚。因此，就必須運用顯微技術(shù)中各種方法將其制成玻片標(biāo)本，使組織細(xì)胞既能在光學(xué)顯微鏡下觀察又可長期保存，結(jié)構(gòu)對比變明顯。一般可分為切片法和非切片法兩類制片方法。第三頁，共二十二頁，2022年，8月28日切片法：石蠟切片法；火棉膠切片法；冰凍切片法等。非切片法：包括整體封藏法；涂布法；壓片法，此外還有鋪片、磨片等。顯微制片需經(jīng)歷一系列操作，相當(dāng)細(xì)致而復(fù)雜，每一步驟的失誤都可導(dǎo)致整體的失敗，因此需要耐心細(xì)致，手腦并用。切片法：取材→固定→沖洗→脫水→透明→包埋→切片→染色→脫水→透明→封藏。非切片法：取材→固定→沖洗→脫水→透明→染色→脫水→透明→封藏第四頁，共二十二頁，2022年，8月28日切片法與非切片法比較切片法能顯示出組織、細(xì)胞內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu),且對比非常明顯清晰。但操作步驟多,手續(xù)復(fù)雜,制片速度慢,耗時較長。如洋蔥根尖縱切片中對線粒體、有絲分裂的觀察;小麥葉片橫切和玉米葉橫切中對細(xì)胞木質(zhì)化細(xì)胞質(zhì)、纖維素細(xì)胞質(zhì)的觀察。切片法是生物顯微制片技術(shù)中最常用和最主要的方法,其中又以石蠟切片法最為重要。非切片法能保持生物體或某部分器官組織的原有狀態(tài)及其完整性,但因不經(jīng)過切片手續(xù),不僅不能清晰地顯示各器官組織之間的相互關(guān)系,更無法顯示組織和細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系。非切片法中整體切片法僅能對很小的材料制片,如人體口腔上皮裝片,草履蟲裝片。涂片法僅對含有大量水分或完全為液體的組織或器官適用。第五頁，共二十二頁，2022年，8月28日1非切片法1.1涂片法主要用于血液、精液、尿液、微生物液體培養(yǎng)物等不能用切片法制成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細(xì)胞，還可再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標(biāo)本。1.2鋪片法主要用于動、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。如:洋蔥表皮細(xì)胞的鋪片制備。第六頁，共二十二頁，2022年，8月28日1.3壓片法一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進(jìn)行觀察，如植物根尖壓片觀察染色體。1.4磨片用于質(zhì)地堅硬的組織，如骨和牙。1.5離析法此法是利用化學(xué)試劑使組織的細(xì)胞間質(zhì)溶解，使組織分散成單個游離細(xì)胞。如植物去壁低滲法制備染色體標(biāo)本。第七頁，共二十二頁，2022年，8月28日2切片法切片是供光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察的動植物組織薄片。

切片法是通過手工或切片機(jī)將組織切成薄片來進(jìn)行觀察的方法。需先經(jīng)過一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片，根據(jù)所用支持劑的種類不同，可分為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟。第八頁，共二十二頁，2022年，8月28日2.1石蠟切片法石蠟切片法包括以下各主要步驟：取材→固定→洗滌和脫水→透明→浸蠟→包埋→切片與粘片→脫蠟→染色→脫水→透明→封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標(biāo)本需要數(shù)日，標(biāo)本片可以長期保存使用。第九頁，共二十二頁，2022年，8月28日詳細(xì)步驟和各個環(huán)節(jié)要求取材：材料必須新鮮、完整，擱置時間過久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細(xì)胞自溶及細(xì)菌的滋生，且避免擠壓、挫傷而不能反映組織活體時的形態(tài)結(jié)構(gòu)。注明采集時間、地點、名稱、組織部位等。組織塊大小以0.5×0.5×0.2cm為宜。固定：用化學(xué)藥液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細(xì)胞和組織中的物質(zhì)成分、終止細(xì)胞的一切代謝過程、防止細(xì)胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時的結(jié)構(gòu)。此外固定還有使組織硬化作用，助染作用。此外還有物理方法如干燥、高熱和低溫驟冷等方法固定。第十頁，共二十二頁，2022年，8月28日洗滌與脫水：洗滌：固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，以免影響以后的染色效果。多以流水沖洗。脫水：洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，需除去水分方可進(jìn)行之后的透明、浸蠟與包埋。脫水用一種既能與水又能與透明劑混溶的液體來逐漸置換樣品中游離的水。脫水劑常采用乙醇或丙酮、正丁醇、叔丁醇進(jìn)行梯度脫水。每次時間為1～數(shù)小時。脫水的過程：通常從30％或50％乙醇開始，一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%脫水劑濃度不應(yīng)跨度太大，以免引起組織強(qiáng)烈的收縮或變形。第十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日

透明透明是用一種既能與脫水劑（乙醇）又能與包埋介質(zhì)（石蠟）互溶的液體來置換樣品中的脫水劑（乙醇），從而為最終的包埋創(chuàng)造一個有利的條件。現(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏油等。一般過程為：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，滲透力強(qiáng)，溶蠟量大，易揮發(fā)，缺點是易使組織收縮，變硬，變脆。第十二頁，共二十二頁，2022年，8月28日浸蠟將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，梯度提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換組織塊中的透明劑，便于之后的包理與切片。浸蠟要在溫箱（60℃，液態(tài)石蠟）中進(jìn)行，每級1-3h。包埋樣品浸蠟后，內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，接著還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以便切片。用鑷子輕輕將浸蠟后的組織塊夾入盛有液態(tài)石蠟的紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。可同時包埋多塊組織。至此，組織材料的前處理過程已完成，可用于切片。第十三頁，共二十二頁，2022年，8月28日切片修塊：切片前需修整蠟塊，先將大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，再修整成正方體或長方體，從切面看組織周圍的石蠟厚度相等(3mm)。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺（臺木）上，以便于固定在切片機(jī)上。切片：調(diào)整切片機(jī)刀片位置與臺木上的蠟面平行

。一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動切片機(jī)，切下的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶根據(jù)需要切成數(shù)段，放在40℃水面上。貼片：蠟帶分別用粘片劑（蛋白甘油）貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺上展平，烘干。第十四頁，共二十二頁，2022年，8月28日第十五頁，共二十二頁，2022年，8月28日脫蠟、水化、染色蠟帶必須先用二甲苯去除石蠟再用乙醇去除二甲苯，再進(jìn)入水中，才能染色。染色的方法很多，要根據(jù)標(biāo)本要求顯示的目的選擇不同的染劑，最常用的是蘇木精-伊紅染色（H·E染色）。蘇木精使細(xì)胞核顯深紫色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)顯粉紅色，可顯示清晰的細(xì)胞形態(tài)和核的大小，位置。染色后再使帶水的切片經(jīng)歷脫水→透明，最后用樹膠封片。第十六頁，共二十二頁，2022年，8月28日HE染色：蘇木精（Hematoxylin）伊紅（Eosin）染色堿性染料將嗜堿性物質(zhì)（本身酸性）染成藍(lán)色酸性染料將嗜酸性物質(zhì)（本身堿性）染成紅色細(xì)胞核中的DNA、RNA細(xì)胞質(zhì)中的RNA細(xì)胞質(zhì)、膜性結(jié)構(gòu)（線粒體、溶酶體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）第十七頁，共二十二頁，2022年，8月28日(l)細(xì)胞核染色劑用于細(xì)胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結(jié)品紫、硫堇、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、孔雀綠和焦油紫等。

(2)細(xì)胞質(zhì)染色劑用于細(xì)胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍(lán)等。（3）脂質(zhì)染色劑用于顯示脂質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、硫酸尼羅藍(lán)及油紅等。第十八頁，共二十二頁，2022年，8月28日其步驟如下：二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→蘇木精染液→0.01%鹽酸→0.01%氫氧化鈉→蒸餾水→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→伊紅染液→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→二甲苯→二甲苯→封片第十九頁，共二十二頁，2022年，8月28日鏡檢、貼標(biāo)簽、干燥、記錄。第二十頁，共二十二頁，2022年，8月28日3石蠟切片實例——魚肝制片材料：魚肝（厚2-3mm，carnoy3-4h/bouin/Zenker固定24h）。試劑：固定液，埃里希蘇木精染液，1%伊紅水溶液，1%鹽酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，30%~100%各級乙醇，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。蘇木精為堿性染料（含陽離子），伊紅為酸性染料，魚肝細(xì)胞核含酸性物質(zhì)，易與堿性染料的陽離子結(jié)合染上藍(lán)色，胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，易與酸性染料中陰離子結(jié)合而染上粉紅色。第二十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗程序：取材（2-3×5×5mm3）→固定（carnoy3-4h，bouin12-24h）→洗滌（70%乙醇3-5次）→脫水（80%、90、100、100%乙醇各0.5h）→透明（乙醇+二甲苯等量混合15min，二甲苯15min2次）→透蠟（二甲苯+石蠟各半35-37℃,0.5h，石蠟56-60℃,0.5h2次）→包埋（凝30min）→切片（8μm，水面展開）→貼片（涂粘片劑，滴水1滴）→展片（40-45℃）→烘干（37℃，24h）→脫蠟（二甲苯2-5min，二甲苯+乙醇2-5min）→復(fù)水（100%、90、80、70、50%、蒸餾水各2min）→染色（埃里希蘇木精染液15-20min）→水洗（2.5min