第四章-酶的提取與分離純化

第四章酶的提取與分離純化預處理（pretreatment）：包括固液分離和細胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。酶純化的基本原則：①建立一個方便靈敏的分析方法；②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟；③常在低溫（4℃）條件下進行純化，以避免酶的變性。第一節(jié)細胞破碎

（一）細胞壁組成

微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌放線菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1%?2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)幾丁質(zhì)(1%~2%)蛋白質(zhì)(6%~8%)脂類(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂類蛋白質(zhì)各種微生物細胞壁的結構與組成

細菌細胞壁的結構

酵母菌細胞壁的結構

M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖

（二）細胞破碎的方法

機械法:攪拌;研磨物理法：滲透壓或溫度突變化學法：化學試劑改變細胞膜結構生物法（酶解）：外加酶法或自溶法第二節(jié)酶的提取(extraction)

把酶從生物組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。

提取原則a.相似相溶。b.遠離等電點的pH值，溶解度增加。提取方法：（一）鹽溶液提取

常用稀鹽（常用NaCl）溶液（鹽溶），對酶穩(wěn)定性好、溶解度大，最常用。

（二）酸、堿溶液提?。ㄈ┯袡C溶劑提取第三節(jié)沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龉爬稀嵱?、簡單的初步分離方法在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：

⑴中性鹽沉淀（鹽析法）

⑵有機溶劑沉淀⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）⑷等電點沉淀⑸復合沉淀法（一）鹽析沉淀法（改變離子強度）1.基本原理（鹽溶和鹽析）

向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。

2)鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。蛋白質(zhì)的鹽析硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度鹽析鹽溶

原因：高鹽：①與蛋白質(zhì)分子爭奪水②中和電荷不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。1）中性鹽的選擇常用（NH4）2SO4

2.鹽析用鹽2)調(diào)整鹽濃度的方式

a.飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達到的鹽濃度又不太高時。

b.添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達到的鹽濃度又很高時。實際使用時，可直接查表（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表鹽析操作低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過40％。高飽和度：固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。1）固體硫酸銨充分研細，溫和攪拌中緩慢加入。2）冰箱中（4℃）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。3）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltration）、透析（dialysis）或?qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。3.離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)）蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關系：I：離子強度S：離子強度為I時的蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）S0：離子強度為0時蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）Ks：鹽析常數(shù)，是與蛋白質(zhì)和鹽有關的特性常數(shù)。Ks代表鹽析效率，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。

當溫度和pH一定時，S0對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用β表示，鹽析方程式可改寫為：

logS=β-KsI

兩種鹽析法：Ks分段鹽析法：在一定的pH和溫度條件下，通過改變離子強度或鹽濃度（即改變I值）使不同酶先后沉淀的方法。β分段鹽析法：在一定鹽和離子強度下，通過改變?nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法。（二）有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）

利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1.沉淀機理

降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水2.常用有機溶劑乙醇、丙酮、甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。

3.優(yōu)缺點：

優(yōu)點：1）分辨率比鹽析法高

2）沉淀不需脫鹽3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活2)有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。

（三）等電點沉淀(isoelectricprecipitation)

1.原理蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點

2.使用方法單獨使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點時仍有一定的溶解度。（四）復合沉淀法

1.作用機理：與有機溶劑類似，是發(fā)展較快的一種新方法。2.沉淀劑：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，簡寫PEG多用分子量為6000～20000的PEG）、單寧等（五）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。

⑴熱變性

⑵pH變性

⑶有機溶劑變性

舉例：牛紅細胞提取Cu，Zn－SOD的生產(chǎn)工藝：新鮮牛血收集除血漿離心紅細胞浮選2％NaCl干凈紅細胞溶血溶血液去血紅蛋白乙醇、氯仿上清分級沉淀丙酮沉淀物熱變性SOD粗酶液超濾濃縮液柱層析精制濃縮液冷凍干燥凍干粉70℃DEAE－sephadexA50第四節(jié)離心分離一基本原理1.離心力

Fc＝mr

ω2＝mr（2N/60）2

N為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；Fc通常以相對離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r

此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關系通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對離心力（RCF）表示，如：65000g。兩者可換算或查測算圖。（直線法）

計算近似RCF的列線圖二離心機的種類按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為：常速（低速）高速超速

名稱

轉(zhuǎn)速(r/min)

注意事項

低速離心機

8000常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡

高速離心機

8000?25000冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡

超速離心機

>25000冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡

離心機的種類

實驗室離心機溫度類型：常溫及冷凍超速離心機均為冷凍型。使用冷凍離心機時提前降溫，預冷離心頭。使用超速離心機時先抽真空。離心的形式角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式由低速到超速均有。角式離心機和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。離心機的大小：落地式及臺式小臺式離心機離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強度：和離心速度相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋離心機操作平衡、定溫、定速、定時。三常用離心方法

差速離心法密度梯度離心等密度梯度離心1．差速離心

（differentialcentrifugation）

采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。

優(yōu)點：操作簡單。缺點：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。2）沉降的顆粒受到擠壓。

差速離心分離示意圖

（a）離心前的懸浮液（b）～（e）離心不同時間后顆粒的沉降情況

2．密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。

常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。特點：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。

密度梯度離心示意圖

（a）離心前（b）離心后

Densitygradientultracentrifugation密度梯度離心

步驟：A.形成密度梯度B.加樣C.離心D.收集樣品3.等密度梯度離心

又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根據(jù)顆粒的密度不同而進行分離。離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。特點：

介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。

等密度梯度離心示意圖

（a）離心前；（b）離心后

四應用根據(jù)不同離心目的，分為制備性離心：分離純化和制備分析性離心：

測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度（生化上P294）

第五節(jié)過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀物質(zhì)分離的技術過程。

非膜過濾：粗濾，部分微濾膜過濾：高分子膜介質(zhì)一、非膜過濾

高分子膜以外的材料：濾紙，濾布，纖維，多孔陶瓷，燒結金屬等1.粗濾（通常所說的過濾）截留直徑大于2μm的大顆粒，使固液分開。根據(jù)推動力的產(chǎn)生條件不同，過濾分為三種：常壓過濾

加壓過濾

減壓過濾2.非膜微濾：微孔陶瓷，燒結金屬作介質(zhì)二、膜分離

借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆粒或分子進行分離的技術。（一）擴散膜分離——透析（dialysis）溶質(zhì)分子Y從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動蛋白質(zhì)透析

1.透析膜

商品透析膜大多制成管(袋）狀。材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預處理：目的：除雜質(zhì)。

2）透析袋的保存：防腐劑＋冷藏。透析袋在使用前最好在EDTA-NaHCO3溶液中煮過，以除去生產(chǎn)過程中混入的有害物質(zhì)，特別還應檢查一下有無破損、泄漏處，這樣才能裝入待透析液，兩頭扎緊，進行透析。一般透析液需更換3—5次。透析袋使用完后，一般可用清水沖洗干凈，再次檢查是否完好，然后浸入75％乙醇溶液中保存?zhèn)溆茫ū洌?.透析方法及裝置

透析袋透析簡單裝置。A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖

3.用途蛋白純化中，除去無機鹽等小分子物質(zhì)。

缺點：透析時間較長，透析后體積較大，濃度較低，難于工業(yè)化生產(chǎn)。（二）加壓膜分離

根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為：截留顆粒直徑操作壓力應用微濾0.2~2m<0.1MPa除菌超濾0.002~0.2m0.1~0.7MPa分離病毒及生物大分子反滲透<0.002m0.7~13MPa純水制備利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應用。超濾(ultrafiltration，UF)反滲透（Reverseosmosis，RO）

利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑(通常是水)的性質(zhì)，對溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。（無離子水制備；海水淡化）滲透與反滲透（三）電場膜分離電滲析：在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負電極。應用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸等帶有電荷的發(fā)酵產(chǎn)物。第六節(jié)層析法層析法也稱色譜法，是1903年俄國植物學家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有CaCO3吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)。一、層析法的基本原理

利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達到分離的目的。mobilephase：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體

stationaryphase：靜止不動的一相

按層析過程的機理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。親和層析：利用生物分子與配基之間專一而又可逆的親和力。層析聚焦：將酶的等電點特性和離子交換特性結合在一起。二、層析法的分類按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。三、層析設備層析裝置：梯度混和器蠕動泵層析柱監(jiān)測儀記錄儀收集器

記錄儀低溫層析柜四、層析操作分離前：1）樹脂預處理：凝膠溶漲。離子交換纖維素需作酸堿處理。2）裝柱：重力沉降法，要求均勻，無氣泡。3）平衡：層析柱使用前，須用緩沖液平衡至所需的pH值和離子強度。層析操作分離中：上樣：體積盡可能小。平衡：用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。洗脫：連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)改變緩沖液的pH或離子強度。階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的pH或離子強度。同時進行分步收集和檢測。

分離后：再生，平衡，保存。蛋白質(zhì)定量-——分光比色儀(A280)法蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr的共軛雙鍵）對紫外光有吸收，以色氨酸吸收最強，最大吸收峰為280nm。在波長280nm具有吸光的氨基酸紫外吸收法平衡、吸附鹽梯度沖洗分管收集蛋白測定制圖測A280（一）吸附層析（adsorptionchromatography）1.原理

利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。五、常用方法吸附作用的強弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關。吸附層析的關鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。2.洗脫方法

溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法3.吸附劑

吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團作用。根據(jù)吸附能力強弱分為：弱吸附劑：蔗糖、淀粉中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣[Ca10(PO4)6.(OH)2]

、硅膠(極性)等強吸附劑：氧化鋁、活性炭(常用)吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則：極性強的吸附劑易吸附極性強的物質(zhì)非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。但為了便于解吸附，對于極性強的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進行吸附。

4.洗脫劑要求：

粘度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分,易與目標分子分離。選擇：

具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相(相似相溶)常用：不飽和烴、醇、醚、水、中性鹽生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。5.應用

分離純化生物大分子（二）凝膠過濾層析

凝膠過濾（gelfiltration）又稱分子篩層析（molecularsievechromatography）、排阻層析（exclusionchromatography）,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進行分離的技術。1.基本原理

大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。按分子量由大→小順序流出層析柱。凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ml）凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時,即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時,即Ve=Vo+Vi，說明該組分能進入凝膠的全部內(nèi)空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。分配系數(shù)Kd的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，Kd差異小，分離效果差。2.凝膠的種類和性質(zhì)

1)交聯(lián)葡聚糖凝膠商品名:Sephadex型號

SephadexG－10至G-200G后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。凝膠型號

顆粒大小/μm

溶脹體積/(ml/g)

分離范圍（Mr）

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004～120

4～120

50～150

50～150

40～120

40～120

40～120

40～120

2～3

2.5～3.5

4～6

9～11

12～15

15～20

20～30

20～30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關參數(shù)

2）瓊脂糖凝膠

商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美國）依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結構，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結構越密集。型號

使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）含瓊脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～150000

1086421

Sepharose及Bio-gelA型號

3）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）

商品名為Bio-Gel,型號從Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔徑也越大。以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。3.操作：1）凝膠的選擇和處理根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應型號的凝膠介質(zhì)。將干膠懸浮于5~10倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。3）加樣體積不能過多，不超過床體積的5％，脫鹽時可在10％左右。4）洗脫洗脫液與平衡時用的buffer一致。洗速不可過快，保持恒速。5）膠的保存洗脫完畢后，凝膠柱已恢復到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。用0.02%NaN3防腐。4.應用1）脫鹽２)生物大分子物質(zhì)的分離純化3）分子量的測定

LogMABCLogM測V測LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）先測得幾種標準蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。蛋白質(zhì)的洗脫體積與其分子量有關（三）離子交換層析

（ionexchangechromatography，IEC）1.原理:利用不同組分對離子交換劑親和力的不同而達到分離的純化方法。1）離子交換劑：離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構成。

如羧甲基纖維素離子交換劑組成纖維素—O—CH2—COO-—H+

載體電荷基團反離子

化學原料合成：樹脂類物質(zhì)載體

天然材料制成：cellulose

sephadexsepharose

陽離子交換劑:電荷基團（－）,反離子（＋）活性基團陰離子交換劑:電荷基團（＋）,反離子（－）

如：DEAE-纖維素，CM-Sepharose離子交換劑--帶有電荷基團的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE)陰離子交換劑(可吸附帶負電的蛋白質(zhì))陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))兩種離子交換劑陽離子交換劑：常用羧甲基（弱酸）

CM—CH2COO－

磺丙基（強酸）

SP—C3H6SO3－陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基（弱堿），季胺乙基（強堿）

DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

離子交換葡聚糖

以SephadexG-25,G-50為骨架，接入離子交換基團。

DEAE（QAE）SephadexA-25，A-50CM（SP）SephadexC-25，C-50

A：anion陰離子

C:cation

陽離子類型說明功能基反離子DEAE-SephadexA-25，A-50弱堿性陰離子交換劑二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25，A-50強堿性陰離子交換劑二乙氨基己基——2-羥丙基氯CM-SephadexC-25，C-50弱酸性陽離子交換劑羧甲基鈉SP-SephadexC-25，C-50強酸性陽離子交換劑磺丙基鈉離子交換葡聚糖

離子交換劑的選擇a.強、弱離子交換劑的選擇：強型：適用的pH范圍廣，制備無離子水

弱型：適用的pH范圍窄，分離生物大分子物質(zhì)

b.陰、陽離子交換劑的選擇：若溶液pH<pI，蛋白質(zhì)帶正電荷，用陽離子交換劑若溶液pH

>pI，蛋白質(zhì)帶負電荷，用陰離子交換劑2）蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)2.陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程平衡吸附去吸附分離結束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-3.操作離子交換劑的預處理裝柱平衡上樣平衡洗脫收集再生1）上樣：上樣體積不十分嚴格。2）洗脫:增加溶液的離子強度

梯度洗脫法

改變?nèi)芤旱膒H值

3）再生：用0.5mol/LNaOH或0.5mol/LHCl處理。4.應用分離純化生物大分子（四）疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）從分離純化的機制看，屬吸附層析類。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì)，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進行分離。大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強的親水性，但分子內(nèi)部存在一個疏水核心，欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補丁（hydrophobicpatch），或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。原理:在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結合在一起，然后通過降低流動相的離子強度，即可將結合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結合力大小，依次進行解吸附。2.吸附劑

親水性（如Sepharose）基質(zhì)固定相疏水性（如硅膠、樹脂）配體（疏水性基團）（苯基、辛基、烷基）產(chǎn)品名稱載體配基生產(chǎn)公司苯基Sepharose4B瓊脂糖凝膠珠苯基Pharnacia辛基Sepharose4B瓊脂糖凝膠珠辛基Pharnacia烷基交聯(lián)瓊脂糖凝膠珠瓊脂糖凝膠珠烷基(Cn)以色列一些商品疏水層析介質(zhì)

3.操作1）加樣：樣品溶液中補加適量的鹽。2）洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3）再生：用水除去固定相吸附的雜質(zhì)。4.應用主要用于分離純化大分子物質(zhì)。

（五）親和層析(AffinityChromatography)

由吸附層析發(fā)展起來的，是從復雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。又稱：生物專一吸附（biospecificadsorption）選擇層析（selectivechromatography）

1.原理

利用生物大分子間特異的親和力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的DNA等。

將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W反應共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來，實現(xiàn)分離提純。+CCC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附2.可被應用的基質(zhì)（載體）：（按性能優(yōu)劣排序）瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。最常用的是瓊脂糖，Sepharose1B到10B3.配體的選擇一對可逆結合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。

優(yōu)良配體須具備的條件：1）與待純化的物質(zhì)有較強的親和力。2）具有與載體共價結合的基團。所要分離的目的產(chǎn)物

相應的配基

酶抗體凝集素激素底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗原、病毒、細胞多糖、糖蛋白、細胞受體受體、載體蛋白

目的產(chǎn)物與相應的配基

4.偶聯(lián)（親和吸附劑的制備）配體一定，改造載體（基質(zhì)）1）基質(zhì)活化：不同的載體活化需要不同的活化劑。常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基2）引入連接臂（spacearm）

又稱手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影響配基與生物大分子的結合的空間障礙?！敖颖邸钡耐緩剑撼Ｓ枚坊衔铮ǘ《?、乙二胺、己二胺）。目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應。如：AH-Sepharose4B常用手臂5.操作：1）層析前：制備親和層析劑

選擇根據(jù)欲分離物質(zhì)特性配基

選擇根據(jù)配基分子大小及基團特性載體2）洗脫：能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯(lián)親和層析劑非專一性洗脫：改變溫度改變pH值改變離子強度專一性洗脫：競爭性洗脫劑（半抗原、抑制劑、底物類似物）被吸附物質(zhì)結合競爭性地與配體結合6.應用1）純化大分子物質(zhì)如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結合碳水化合物的蛋白質(zhì)），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的結構與功能：分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。

該法是在等電點聚焦方法基礎上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到被洗出。（六）層析聚焦（Chromatofocusing）層析時的聚焦效應示意圖層析聚焦的操作過程：1.選擇適宜的多緩沖液離子交換劑和多緩沖液溶液2.pH梯度溶液的形成

例：PBE94陰離子交換劑：起始buffer平衡到pH=9，再用pH=6buffer流過層析柱3.蛋白質(zhì)的層析聚焦

層析介質(zhì)pH〈pIPr+下移

層析介質(zhì)pH〉pIPr-與柱結合4.洗脫過程：pH=6buffer洗脫，pH下降，Pr+下移；pH〉pI，Pr-與柱結合，不斷重復洗脫-吸附-再洗脫，Pr按pI大小而被分離5.再生：同步驟2第七節(jié)電泳分離電泳（electrophoresis,EP）：

指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動的過程。電泳技術是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進行分離的實驗技術。一、電泳的基本理論

1.原理:在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。

+-

影響遷移率的因素：1）顆粒性質(zhì)：Q越大、r越小、形狀越接近球形，v越快。2）電場強度：E越高，v越快。3）溶液性質(zhì)：

pH值：離pI越遠，v越快。（用buffer保持恒定）離子強度：離子強度越高，v越低。原因：離子氛（ionicatmosphere）。

通常，緩沖液離子強度在0.02-0.2之間。4）電滲：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。應避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。自由界面電泳：又稱移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。區(qū)帶電泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。

2.電泳的分類按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。

③瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應。④聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)。

3.電泳常用設備

（1）電泳儀：為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。

常壓電泳儀（600V）

高壓電泳儀（3000V）

超高壓電泳儀（30000V～50000V）（2）電泳槽：

自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽（3）附屬設備：

水平板式電泳槽垂直板式電泳槽二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。

1.凝膠制備

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑和加速劑作用下聚合的。并且可以通過改變丙烯酰胺濃度和交聯(lián)劑濃度而制成不同孔徑的凝膠。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1）化學催化系統(tǒng)：AP-TEMED催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（TEMED）催化劑:核黃素（維生素B2）

引發(fā)劑:光TEMED的存在，可加速聚合。.聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉雙丙烯酰胺聚合而成凝膠的機械強度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）。

T=

C=凝膠濃度越大（?。讖皆叫。ù螅?，可分離分子量較小（大）的顆粒。

Acr與Bis的重量比應在30左右。

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%樣品分子量（Da）適宜的凝膠濃度（％）蛋白質(zhì)<1041～4×1044×104～1×105105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表2.操作：（SDS及PAGE，即變性及非變性）1）準備：貯存液制備；玻璃板（管）洗凈干燥2）制膠:（變性：buffer中加0.4%SDS）a.分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠（查表），配制分離膠溶液：Acr:Bis=29:1，分離膠buffer,TEMED,AP,水迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h聚合完全。b.濃縮膠：用濃縮膠buffer。插上梳子。3）樣品制備：

a.PAGE:樣品＋樣品緩沖液（蔗糖或甘油＋指示劑溴酚藍）b.SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS，甘油，巰基乙醇，溴酚藍），煮沸2~5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。4）加樣及電泳：

拔掉梳子，膠上留下凹槽，加樣，倒入電極緩沖液到電泳槽中，接通電源，電泳。溴酚藍距下端1cm時停止電泳。SDS:電極buffer中加0.1%SDS5）染色及脫色a.染色：

考馬斯亮藍染色法

銀染法（靈敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍等。b.脫色：用脫色液脫色至膠的藍色完全褪去，在無顏色的凝膠上看見清晰的藍色條帶。3.分離效應

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應，分為：不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)電荷效應不連續(xù)PAGE分子篩效應濃縮效應

連續(xù)PAGE1）電荷效應:分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。2）分子篩效應：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。3）濃縮效應：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進入分離膠進行分離。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：

1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。因此，在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效應，提高了分辨率。8.38.38.96.7聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品緩沖液pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

4.應用：（少量）蛋白質(zhì)的分離純化純度鑒定三、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）簡稱SDS－PAGE。是目前測定蛋白質(zhì)亞基相對分子量（relativemolecularmass,Mr）的一種最好的辦法。

SDSseparatesproteins1.原理：

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負電荷，與蛋白質(zhì)結合后使蛋白質(zhì)所帶負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質(zhì)構象改變，使蛋白質(zhì)－SDS復合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此，蛋白質(zhì)—SDS復合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關。2.操作（見前文）3.應用：蛋白質(zhì)亞基相對分子量的測定蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：logM=K-bXM：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)

將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)其相對遷移率即可在標準曲線上求得分子量。四、等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pI

的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）。1.原理

兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動，當遷移至pH值等于pI處時不再泳動，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。等電聚焦電泳2.操作：

1）凝膠配制：兩性電解質(zhì)載體在凝膠聚合之前加到混合液中，然后凝膠。凝膠濃度T為5％~7.5％（C=3%左右）2）加樣：任意位置

3）電泳：陽極：磷酸溶液電極溶液陰極：NaOH溶液只有在凝膠兩端給予高電壓（600V）時，才能獲得較好的分辨率。凝膠聚焦電泳一般需12h。4）固定及染色：TCA固定（凝膠浸泡在5％的三氯乙酸中去除兩性電解質(zhì)），考馬斯亮藍染色。5）等電點測定：Marker與未知樣品同時電泳染色后，以pH值為縱軸，距陰極距離為橫軸，做pH梯度標準曲線，據(jù)未知蛋白遷移距離可推知pI。IEF測定蛋白質(zhì)pI3.應用：蛋白質(zhì)的分離純化測等電點第八節(jié)萃?。╡xtraction）分離利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間溶解度的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。特點：1）比沉淀法分離程度高2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快3）比蒸餾法能耗低

普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質(zhì)的分離，

因為:1）蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑2）蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取。

（一）有機溶劑萃取

萃取操作的3個步驟：1）混合2）分離3）溶劑回收（二）雙水相萃取技術

又稱水溶液兩相分配技術（partionoftwoaqueousphasesystem）

用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）進行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達70%?90%），故稱“雙水相”系統(tǒng)。優(yōu)點：1）每一水相中均有很高的含水量，為酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境；2）PEG、Dextran和無機鹽對酶等無毒害作用，不會引起變性。

雙水相的形成：

兩種不同水溶性聚合物濃度達到一定值時，體系會自然地分成互不相容的兩相，構成雙水相體系。

a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點PEG/Dx和PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖

幾種典型的雙水相系統(tǒng)聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羥丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽甲基纖維素聚乙二醇（PEG）

磷酸鉀、硫酸銨硫酸鈉、硫酸鎂2.萃取原理：

利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。3.應用

胞內(nèi)酶的提取和精制:除去細胞碎片，并使酶得到純化。

通常將目的蛋白分配在上相（PEG）,細胞碎片分配在下相（鹽）幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例

酶菌種相系統(tǒng)延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/鹽天冬氨酸酶E.coliPEG/鹽-半乳糖苷酶E.coliPEG/鹽亮氨酸脫氫酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脫氫酶Baker’syeastPEG/鹽青霉素?；窫.coliPEG/鹽雙水相萃取法的重要研究方向——親和萃?。ㄓH和分配）在高分子聚合物（如PEG）上引入—具有生物特異性的配基（ligand）來提高分離選擇性。

親和萃取酶實例

蛋白質(zhì)配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑磷酸果糖激酶三嗪染料甲酸脫氫酶三嗪染料葡糖-6-磷酸脫氫酶三嗪染料一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法，它是將胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上，并獲得適當分子量的胰蛋白酶-PEG聚合物，從而建立親和雙水相萃取體系，牛肺經(jīng)過除雜、切塊、搗碎后用硫酸酸解，然后過濾，濾液經(jīng)過親和雙水相萃取后，最終的上相經(jīng)過超濾脫鹽和冷凍干燥后獲得高純度的抑肽酶產(chǎn)品。

（三）超臨界流體萃取

兼有蒸餾和溶液萃取的特征，與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。超臨界流體(supercriticalfluid，SCF）：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點——臨界點后的流體。SCF性質(zhì)介于液體和氣體之間：1)SCF密度接近于液體，溶解度高。2)SCF粘度和擴散系數(shù)接近于氣體，傳質(zhì)擴散快?；具^程：1）在SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。2）降低壓力或升溫，使SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。常用超臨界液態(tài)CO2作為萃取劑，

因為：1）液體CO2無毒2）臨界溫度（304.06K）接近常溫3）臨界壓力（7.38MPa）較低4）操作安全超臨界CO2萃取技術在生物、食品等工業(yè)中的應用

CO2萃取部分產(chǎn)品原料名稱產(chǎn)物名稱原料名稱產(chǎn)物名稱小麥胚芽胚芽油豆子豆油精煉油啤酒花啤酒花精油茉莉花凈油辣椒辣椒紅色素菊花根除蟲菊酯當歸精油紫草紫草寧銀杏葉銀杏內(nèi)酯花生精煉油超臨界CO2萃取有萃取和分離兩步驟分離工藝分三種：①等壓分離（萃取罐加熱器分離罐②等溫分離（萃取罐膨脹閥分離罐）③吸附分離（分離罐中置吸附劑）（四）反膠團萃取1.反膠團：又稱反膠束（ReversedMicelles）指表面活性劑（由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù)有機溶劑中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體。反膠團模型親水基團向內(nèi)聚集（正）膠束反膠束形成表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。構造表面活性劑極性基團在外，非極性基團在內(nèi)，形成非極性核心。表面活性劑非極性基團在外，極性基團在內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池（waterpool）。功能溶解非極性物質(zhì)溶解極性物質(zhì)2.萃取過程第一步：將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步：將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。

反膠團萃取原理

3.表面活性劑及有機溶劑

反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。（1）表面活性劑

常用：AOT(AerosolOT)（陰離子表面活性劑，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸鈉）。特點：易獲得，強度好；極性基團小，形成的反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進入。

（2）非極性有機溶劑環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。

4.優(yōu)點1）萃取率和反萃取率高。2）分離濃縮同時進行。3）解決胞內(nèi)酶在非細胞環(huán)境中迅速失活問題。4）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。5）成本低，溶劑可反復利用。第九節(jié)

酶的濃縮、干燥與結晶一、酶的濃縮

(一)蒸發(fā)濃縮

圖4-60減壓蒸發(fā)濃縮的簡易裝置1蒸餾瓶2毛細管3螺旋夾4橡皮管5溫度計6出水口7冷凝器8進水口9連接管10抽氣口11接收瓶（二）

超濾濃縮

超濾(ultrafiltration)濃縮以壓力差為動力，將待濃縮溶液通過超濾膜，酶分子較大被滯留，水分子和小分子選擇性透過，達到濃縮目的。圖4-61

酶的超濾濃縮

（三）吸水劑

1.膠過濾濃縮：

利用葡聚糖凝膠SephadexG-25或G-50等的吸水特性。將干膠直接加入樣品溶液，吸水膨潤后，再過濾或離心分出濃縮的酶液。2.聚乙二醇濃縮：聚乙二醇（polyethyleneglycol），簡稱PEG。

利用PEG的吸水特性。將PEG涂于裝有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和鹽類，酶溶液即被濃縮。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG進入蛋白質(zhì)溶液。（四）反復凍融濃縮利用酶溶液相對于純水冰點較低的原理使酶分子與小分子物質(zhì)分離。

（五）沉淀法鹽析法，有機溶劑法二、酶的干燥

酶的干燥多采用冷凍干燥法。

將酶溶液在較低溫度下（-10℃~-50℃）凍結成固態(tài)，然后在高度真空條件下，將其中固態(tài)水分直接升華為氣態(tài)而除去，也稱酶的升華干燥。

三、酶的結晶

結晶（Crystallization）是指物質(zhì)以晶體的狀態(tài)從蒸汽或溶液中析出的過程。

晶體沉淀——分子排列有規(guī)則蛋白質(zhì)沉淀

非晶體沉淀——分子排列無規(guī)則（無定形沉淀）

晶體內(nèi)部有規(guī)律的結構決定了晶體的形成必須是相同的原子、離子或分子。

過飽和溶液的形成是結晶的原推動力和首要條件。

（一）結晶的條件

酶的純度

純度越高越易結晶（>50％

）

2.酶