實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR技術(shù)第一頁，共六十頁，2022年，8月28日內(nèi)容概要熒光定量PCR的基本概念熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項第二頁，共六十頁，2022年，8月28日常規(guī)PCR與實時熒光定量PCR常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析實時熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析第三頁，共六十頁，2022年，8月28日熒光定量PCR常用的三個概念擴增曲線熒光閾值CT值第四頁，共六十頁，2022年，8月28日Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLg－linerphase平臺期熒光基團熒光檢測元件擴增曲線第五頁，共六十頁，2022年，8月28日Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLg－linerphase

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過閾值Threshold熒光閾值平臺期第六頁，共六十頁，2022年，8月28日Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）CtvalueCt值Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性第七頁，共六十頁，2022年，8月28日Ct值的數(shù)學原理理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數(shù)得:

logXn=log[X0(1+Ex)n]

整理方程式得:logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達到C(t)值時終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+

logXc(t)初始濃度的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率第八頁，共六十頁，2022年，8月28日CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。Ct值與模板起始量的關(guān)系第九頁，共六十頁，2022年，8月28日qPCR常用實驗方法簡單成本較低適用于多重PCR特異性較好可進行SNP檢測特異性非常好ABC第十頁，共六十頁，2022年，8月28日SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料SYBRGreenI第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——作用機理第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日問題點：

SYBRGreenI與雙鏈DNA進行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時被檢測，從而可能導致檢測結(jié)果不準確。SYBRGreenI染料法——問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵點：

設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增！第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日將溫度與熒光強度的變化求導(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確SYBRGreenI染料法——融解曲線第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日

使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜探針具有價格優(yōu)勢優(yōu)點

無模板特異性對引物特異性要求較高不能進行多重定量靈敏度相對較低缺點SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日Taqman探針法——原理

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日1、引物、探針的設(shè)計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：100-900nM

探針濃度：50-300nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日

高度特異性重復(fù)性好靈敏度高可進行多重定量優(yōu)點

只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點Taqman探針法——優(yōu)缺點第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日

標記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑實時熒光定量PCR的分類－－分子信標第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日FRET實時熒光定量PCR的分類——分子信標第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日高特異性：對目標序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點

只能用于一個特定目標設(shè)計困難價格比較高缺點實時熒光定量PCR的分類——分子信標第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日

幾種方法的應(yīng)用比較方法優(yōu)點缺點適用范圍SYBRGreenI適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究TaqMan特異性高重復(fù)性好價格高只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon高特異性熒光背景低只適合特定目標設(shè)計困難價格高特定基因分析SNP分析第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日絕對定量標準曲線由已知濃度的RNA、質(zhì)粒生成定量未知模板標準樣品和未知樣品必須同時反應(yīng)相對定量

CtMethod:使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品目的基因，參照基因可以與目的基因同時反應(yīng)，也可以單獨反應(yīng)。雙標準曲線法：對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。絕對定量vs相對定量第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日Sample25絕對定量

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,即得到該擴增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日一個目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標準樣本

——用來生成標準曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性。標記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實驗結(jié)果顯示——擴增曲線；標準曲線；融解曲線（探針法不需要）。絕對定量分析幾要素第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014

倍比梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v質(zhì)粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計算第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日

方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

試劑：RealMasterMix（Probe）

標準品：質(zhì)粒標準品濃度為106、105

、104

、103

；2個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照

實驗步驟：提取HBVDNA；設(shè)計特異引物；設(shè)計TaqMan探針并標記探針；熒光定量擴增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標準品5×10328.1828.6428.410.16標準品5×10425.2525.1425.190.04標準品5×10522.1122.4622.280.12標準品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數(shù)據(jù)乙肝病人血液中HBV的絕對定量第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日擴增效率（E）計算

E=10-1/slope

－1=10-1/-3.29

－1

=2.01－1=1.01標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線y=-3.29x+40.33R2=0.9978乙肝病人血液中HBV的絕對定量

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴增效率（E）：0.9-1.1,越接近1，越理想。第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03

=1,071,519copies乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-40.33-3.29=6.03第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數(shù)相同實際目的基因表達量分析相對定量的必要性第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日一個參照樣本一個或一個以上的未知樣本一個目的基因管家基因——用來校對不同樣本之間目的基因的實際表達量重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個樣本設(shè)置三個或三個以上重復(fù)孔，以確保統(tǒng)計結(jié)果的可信度。標記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實驗結(jié)果顯示——擴增曲線；標準曲線；融解曲線（探針法不需要）。一組標準樣本（有些分析方法不需要）相對定量分析幾要素第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日管家基因

維持細胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日

雙標準曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析方法第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日相對定量分析實例分析利用TaqMan法研究ERBB2在正?；蛉橄倌[瘤組織標本中的表達差異已知在50%的乳腺腫瘤樣本中,ERBB2表達異常,因此可以作為一個檢測標準選用GAPDH作為內(nèi)標基因FAM標記的ERBB2探針VIC標記的GAPDH探針構(gòu)建標準曲線雙重PCR反應(yīng)陰性對照無RNA對照（空白）無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（基因組）第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日雙標準曲線法Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日樣品擴增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤腫瘤正常正常第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日雙標準曲線法——實驗結(jié)果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表達MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8628.34±0.1026.83±0.03GAPDH表達第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/μlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011=1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression雙標準曲線法——結(jié)果分析第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.18結(jié)果與雙標準曲線法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNABBER2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.212法——實驗結(jié)果－△△Ct第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機濃度確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計檢測電泳檢測第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日cDNA的合成反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析上機AMVM-MLVQuant下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日cDNA合成(兩步法qRT-PCR)qPCR關(guān)鍵cDNA影響qPCR敏感度全長cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只識別mRNA，合成cDNA序列靠近3’隨機引物:隨機合成序列，可能合成非編碼RNA，造成定量結(jié)果高估兩者混合結(jié)合兩者優(yōu)點好的qPCR結(jié)果依賴于成功的cDNA合成第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日定量體系配備引物設(shè)計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標準曲線設(shè)定濃度區(qū)間使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復(fù)＜4個無二級結(jié)構(gòu)擴增長度：100－200bp第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日維基百科/google輸入待查基因名稱選擇物種mRNA找出目的mRNA輸入要查找的蛋白或是基因名稱NCBICOPY名稱到NCBI重新檢索目的mRNA序列文獻Real-TimePCR引物序列Blast確定引物特異性引物設(shè)計第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日SYBR引物設(shè)計原則SYBR-Green引物引物長度18-30bp，產(chǎn)物長度范圍100~400bpG/C含量:40-60%避免引物內(nèi)含有互補序列(尤其是3’端)避免3’端錯配3’端不能出現(xiàn)連續(xù)三個以上的G或C避免3’端出現(xiàn)T堿基設(shè)計夸內(nèi)含子引物第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日TaqMan探針和引物設(shè)計TaqMan探針

-Tm值比引物高10℃

-沒有連續(xù)相同的堿基

-探針位置盡可能地靠近上游引物

-C遠遠多于G-5‘端沒有GTaqMan引物

-Tm(58-600C)

-15-30basesinlength

-G+Ccontent30-80%

-不要有連續(xù)4個G

-3’端不能有連續(xù)兩個以上的G+C

-5‘端不要有G(AorCpreferred)-引物之間的TM相差避免超過2℃

-擴增長度50-150bp(max400)

-引物跨越內(nèi)含子第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日免費的基于網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計軟件Primer5（）-引物和雙標記水解探針的設(shè)計-Tm的計算MFold（）-引物和擴增產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測-二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(deltaG)和融解溫度(Tm)BLAST（）-結(jié)構(gòu)特異性第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日對照設(shè)置陰性對照Negativecontrol:Notemplate(NTC)：檢驗是否有模板污染Noreversetranscriptase(NRT):檢驗RNA樣品中是否有DNA污染Noamplificationcontrol(NAC):檢驗是否有聚合酶污染Noprobecontrol(NPC):檢驗熒光污染Buffer:Onlycontainsbuffer:檢驗背景熒光陽性對照Calibrator:可以用帶有PCR擴增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；質(zhì)粒DNA；克隆到質(zhì)粒的cDNA；體外反轉(zhuǎn)錄的RNA；ReferenceRNApools；來自于特定的生物體樣本的RNA或DNA及國際上公認的生物學標準物。Standardcurve第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日反應(yīng)體系優(yōu)化上機反應(yīng)條件優(yōu)化cDNA的合成樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產(chǎn)物長度決定反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化Mg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)重復(fù)性擴增效率：90％－110％：std＜0.2標準曲線：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法實驗流程及注意事項標準品待測樣本陽性對照陰性對照第五十二頁，共六十頁，2022年，8月28日技能要求誤差控制儀器介紹上機（qPCR）試劑選擇cDNA的合成樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGs