實驗二培養(yǎng)基的制備及滅菌

實驗二培養(yǎng)基的制備及滅菌第一頁，共三十一頁，2022年，8月28日一、實驗?zāi)康?、了解培養(yǎng)基制備原理，學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基制備方法。2、掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的原理和方法。第二頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、基本原理（一）培養(yǎng)基的制備原理培養(yǎng)基是微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。從營養(yǎng)角度分析：?營養(yǎng)：碳源、氮源、生長因子、水分和無機鹽等；?適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力；?一定的氧化還原電位；?合適的滲透壓。第三頁，共三十一頁，2022年，8月28日（二）滅菌原理1、干熱滅菌原理

干熱是指相對濕度在20％以下的高熱。干熱消毒滅菌是由空氣導(dǎo)熱，傳熱效果較慢。一般繁殖體在干熱80－100℃中經(jīng)1小時可以殺死，芽孢需160－170℃經(jīng)2小時方可殺死。第四頁，共三十一頁，2022年，8月28日第五頁，共三十一頁，2022年，8月28日2、干熱滅菌操作步驟（1）在移液管尾部塞上少許棉花，然后用報紙條包好；用報紙條包好干燥的培養(yǎng)皿。（2）將待滅菌物品包扎好，均勻放入烘箱內(nèi)，注意不要擺的太擠，以免妨礙氣流流通。（3）開啟電源，設(shè)定溫度為160℃~170℃

，保持此溫度1~2小時。（4）切斷電源，待溫度降至70℃以下時，打開箱門，取出滅菌物品。第六頁，共三十一頁，2022年，8月28日第七頁，共三十一頁，2022年，8月28日2、濕熱滅菌原理－高壓蒸汽滅菌

在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。第八頁，共三十一頁，2022年，8月28日高壓蒸汽滅菌操作步驟（1）加水：

直接加水至鍋內(nèi)底部隔板以下1/3處。有加水口者由加水口加入至止水線處。（2）裝鍋：

把需滅菌的器物放入鍋內(nèi)，關(guān)嚴(yán)鍋蓋。（3）接通熱源：

將鍋蓋上排氣閥關(guān)閉，同時打開底部排氣閥。待見有大量水汽排出時，維持3～5min，關(guān)上底部排氣閥。第九頁，共三十一頁，2022年，8月28日（4）升壓、升溫：

關(guān)閉排氣閥以后，鍋內(nèi)成為密閉系統(tǒng)，蒸汽不斷增多，壓力計和溫度計的指針上升，當(dāng)壓力達(dá)到1.05kg/cm2（溫度為121℃）即滅菌開始，這時維持在1.05kg/cm2，20～30min。除含糖培養(yǎng)基用0.56kg/cm2壓力外，一般都用1.05kg/cm2壓力。（5）切斷電源：

達(dá)到滅菌時間要求后停止加熱，任其自然降壓，當(dāng)指針回到0時，打開排氣閥。高壓蒸汽滅菌操作步驟第十頁，共三十一頁，2022年，8月28日（6）揭開鍋蓋，取出滅菌物，排掉鍋內(nèi)剩余水。（7）待培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩８邏赫羝麥缇僮鞑襟E第十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日注意事項?。?）滅菌物不要裝得太滿，否則滅菌不徹底。（2）蓋上鍋蓋，以兩兩對稱方式同時旋緊螺栓，勿使漏氣。（3）排氣閥不能過早打開，否則培養(yǎng)基因壓力突降，溫度沒下降會使培養(yǎng)基翻騰沖到棉塞處，既損失培養(yǎng)基又沾污了棉塞。第十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日三、實驗器材1、藥品：瓊脂，10％HCL（各組自配），10%NaOH（各組自配），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏I號培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖（蔗糖）瓊脂培養(yǎng)基（PDA）的配方藥品。2、材料：刻度1000mL塘瓷量杯，天平，試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，藥匙，pH試紙，棉花，報紙，麻繩，標(biāo)簽，培養(yǎng)皿等。3、設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等。第十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日四、實驗方法及步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備

1、稱量2、溶解3、調(diào)pH4、過濾5、分裝6、加塞7、包扎8、滅菌9、擱置斜面10、無菌檢查步驟牛肉膏

3g

蛋白胨10gNaCl5g

瓊脂20g水1000mL

pH7.4~7.6

配方第十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日1、稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取所需藥品放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。第十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日3、調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達(dá)7.6，反之，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計進(jìn)行。第十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日4、過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利結(jié)果的觀察。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。第十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日2、溶解在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補足所失的水分。

第十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日5、分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。

(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。(3)半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。第十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日第二十頁，共三十一頁，2022年，8月28日6、加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。第二十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日7、包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。第二十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日8、滅菌將上述培養(yǎng)基以121℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。第二十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日9、擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜面長度不要超過試管總長的一半。第二十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日10、無菌檢查為檢查滅菌是否徹底，需將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24-48小時。

第二十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日（二）馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基的制備(真菌用)馬鈴薯

200g

蒸餾水

1000mL蔗糖（葡萄糖）

20g

pH

自然瓊脂

20g第二十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日馬鈴薯汁制備：將馬鈴薯去皮，稱量所需重量，切成小塊，加水煮沸30min。用濾紙或雙層紗布(中間夾一層脫脂棉花)趁熱過濾。濾液煮沸后加糖，用于培養(yǎng)霉菌的加入蔗糖，用于培養(yǎng)酵母菌的加入葡萄糖，再加入其它。其余同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備。第二十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日（三）高氏I號培養(yǎng)基的制備(放線菌菌用)可溶性淀粉

20g

KNO3

1gNaCl

0.5g

K2HPO4?3H2O

0.5gMgSO4?7H2O

0.5g

FeSO4?7H2O

0.01g瓊脂

20g

水

1000mLpH

第二十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日按配方先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全熔化，然后再稱取其各成分依次熔化。對微量成分FeSO4?7H2O，可先在100mL水中加入1g的FeSO4?7H2O，配成0.01g/mL，再在10000mL培養(yǎng)基中加1mL的0.01g/mL的貯備液。其它同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配置。第二十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日注意事項?。?）在制備固體培養(yǎng)基加熱融化瓊脂時要不斷攪拌，避免瓊脂糊底燒焦。（2）液體培養(yǎng)基：分裝高度以試管的1/4左右為宜。（3）固體培養(yǎng)基：分裝試管，其裝量為管高的1/6~1/5

滅菌后制成斜面。分裝三角瓶容量以一半為宜。（4）半固體培養(yǎng)基：分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后，垂直待凝成半固體深層瓊脂。（5）不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干凈的紗布擦干凈。第