實驗四濃度測定及酶切

實驗四濃度測定及酶切第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測定DNA溶液濃度和純度的原理和方法2、學(xué)習(xí)利用瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度的方法3、學(xué)習(xí)利用限制性內(nèi)切酶切割DNA的方法，并通過電泳檢測酶切的效果，為以后的連接作準(zhǔn)備。一、實驗?zāi)康牡诙?，共二十九頁?022年，8月28日DNA的吸收光譜峰在260nm處，測定此波長下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時，雙鏈DNA含量約為50g/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處，在測定DNA含量時，還常計算OD260/OD280之值，如該值為時，認為已達到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)含雜質(zhì)較多，可能影響酶切反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)I型、II型和III三類不同的限制性內(nèi)切酶，其中II型能專一識別堿基順序，并在該處切斷雙鏈DNA，因而在基因工程中得到廣泛應(yīng)用。DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生兩種斷裂狀態(tài)：粘性末端或平末端。限制性內(nèi)切酶HindIII識別的堿基序列為：酶切反應(yīng)需Mg2+及其它一些輔助離子和一定的鹽離子濃度，不同內(nèi)切酶對鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量過高(>5%)，會使酶的識別位點發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性(staractivity)。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度37℃，也有個別要求在50~65℃。二、實驗原理第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日不同核酸樣品在OD260=1時的濃度1、OD260：估算核算濃度2、OD280：估算核算濃度3、OD260：估算核算濃度4、OD260：估算核算濃度OD（opticaldensity，光密度）：表示被測物吸掉的光密度。第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日不同核酸樣品在OD260=1時的濃度1、dsDNA=50g/ml(ng/l)2、ssDNA=37g/ml3、RNA=40g/ml4、oligo=30g/mlOD（opticaldensity，光密度）：表示被測物吸掉的光密度。第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日三、實驗材料（上次實驗提取的質(zhì)粒pSK和MP3）第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日四、儀器設(shè)備五、實驗用具Eppendorf分光光度檢測儀NanoDrop分光光度檢測儀電泳儀

微型電泳槽

BioRad凝膠成像儀

紫外透射檢測儀

恒溫培養(yǎng)箱

冰盒微量離心管移液器微量離心管（1.5ml1）

吸管頭若干

點樣板第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日NanoDrop分光光度檢測儀第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日NanoDrop測定結(jié)果DNA樣品純度好DNA樣品純度差DNA樣品純度差第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日比色皿Eppendorf分光光度檢測儀第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日六、試劑瓊脂糖5TBE電泳緩沖液

10載樣緩沖液（loadingbuffer）

GoldViewI型核酸染色劑（10000）DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAmarker）：MarkerIII已知系列濃度的λDNA（線性DNA分子，長約50kb）(10、20、50、100ng/l)第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日七、實驗步驟（一）分光光度計法測定DNA的濃度和純度

（二）瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA濃度（1%agarosegel）

（三）質(zhì)粒DNA的小量酶切（四）酶切質(zhì)粒DNA的電泳（1.5%agarosegel）（五）MP3質(zhì)粒的大量酶切第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、Eppendorf分光光度檢測儀：取質(zhì)粒DNA2l（約100-200ng）至一干凈的離心管，加入198l蒸餾水稀釋，充分混勻。先加200l蒸餾水至比色杯，進行紫外光空白測定，然后倒掉蒸餾水，加入200l已稀釋的DNA溶液，測定260nm及280nm的光吸收值（OD260及OD280），計算DNA濃度、OD260/OD280（估計核酸純度）及OD260/OD230（估計去鹽程度）比值。（自配溶液提取的質(zhì)粒DNA）2、NanoDrop分光光度檢測儀：先加1l蒸餾水進行紫外光空白測定，然后用濾紙吸掉蒸餾水，加入1lElute溶液，測定上述數(shù)值。（制劑盒提取的質(zhì)粒DNA）（一）分光光度計法測定DNA的濃度和純度

第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、利用ddH2O將質(zhì)粒DNA稀釋到濃度為10-100ng/l之間，然后分別取稀釋的DNA樣品和已知濃度的λDNA各1l于點樣板小孔中，再加入8lTE和1l的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。同時點5lMarkerⅢ作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。2、打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，約半個小時后即可觀察。3、將電泳好的凝膠置于紫外透射檢測儀上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到綠色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細和熒光強度，對比已知濃度的λDNA條帶的粗細和熒光強度，可粗略估計該樣品DNA的濃度。同時根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。（二）瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA濃度（1%agarosegel）

第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日（三）質(zhì)粒DNA的小量酶切20l反應(yīng)體系（1.5ml離心管）：質(zhì)粒DNA（pSK、MP3）3~5

l（0.5-1g）酶切Buffer

2.0

l

Hind

III酶1.0

l滅菌ddH2O

to

20l加樣順序：水、buffer、DNA、酶37℃恒溫箱中放置數(shù)小時或者酶切過夜

第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、配制1.5%的瓊脂糖凝膠2、酶切的DNA中加入2l的10×loadingbuffer，混勻后取20l上樣，同時點未酶切質(zhì)粒DNA（50-100ng）進行遷移率對比，取5lMarkerⅢ點樣作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。3、電泳結(jié)束后分析酶切后質(zhì)粒條帶的變化、遷移率和不同條帶之間的亮度差異；同時根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。（三）酶切質(zhì)粒DNA的電泳第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日（四）MP3質(zhì)粒的大量酶切100l反應(yīng)體系（1.5ml離心管）：

MP3質(zhì)粒DNA

2-4

g（試劑盒抽提）酶切Buffer

10

l

Hind

III酶2-4

l滅菌ddH2O

upto

100l加樣順序：水、buffer、DNA、酶37℃恒溫箱酶切過夜

第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日MP3和pSK（+）質(zhì)粒DNA的HindIII酶切結(jié)果第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日MP3和pSK（+）質(zhì)粒DNA的HindIII酶切結(jié)果第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日2，

完成檢測后合上滑蓋，關(guān)閉電源。

第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日分光光度計法測定大腸桿菌液體培養(yǎng)物的OD600值細菌OD的測定原理是細菌顆粒的遮光，可以用來檢測細胞數(shù)量，而通過數(shù)量能反映出細胞生長的狀態(tài)。菌液濃度太高，用培養(yǎng)基稀釋可以降低OD值，但是太高濃度OD值的菌液可能細菌的生長狀態(tài)不符合要求，比如死的菌體會比較多等。1、在使用分光光度計時，測得的OD值在0

.1-0.4這個區(qū)間內(nèi)最可靠，最好不要超過1.0。因此OD盡量控制在0.1-1之間，最多不要超過2.0。取值的時候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)最好。2、空白用不接種的培養(yǎng)基，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時培養(yǎng)，以求條件一致。3、OD與體積或者說稀釋倍數(shù)不一定成正比，如果OD大于2.0，一般要稀釋后再測，而不能根據(jù)之前的檢測結(jié)果稀釋，因為OD太大了就會超過檢測范圍，靈敏度顯著降低。4、OD值是透光率，跟體積沒關(guān)系，只跟菌濃度有關(guān)系，而且只有在一定的吸光值范圍內(nèi)成線性關(guān)系，一般在范圍內(nèi)。第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日雙酶切時不要選擇識別位點有部分重疊或者太靠近的酶！M13F：5’-gTAAAACgACggCCAgTg-3’

M13R：5’-ggAAACAgCTATgACCATg-3’第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日載體單酶切：酶切后需要進行脫磷，防止載體自連，而且連接后外源片段插入的方向不能固定，只能通過酶切檢測或者測序判斷。載體雙酶切：外源片段插入的方向是固定的，由目的片段兩側(cè)的酶切位點（往往通過PCR引物加入的酶切位點所確定，但要注意選擇的兩種酶在多克隆位點里有一定的距離，最好識別位點不要相互重疊，否則會造成酶切困難。載體單酶切和雙酶切的注意事項NotI：GCGGCCGCXbaI：TCTAGASpeI：ACTAGTCGCCGGCGAGATCTTGATCA第二十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日NotI：GCGGCCGCXbaI：TCTAGASpeI：ACTAGTCGCCGGCGAGATCTTGATCACleavageClosetotheEndofDNAFragments(linearizedvector)"BasePairsfromEnd"referstothenumberofdouble-strandedbasepairsbetweentherecognitionsiteandtheterminusofthefragment;thisnumberdoesnotincludethesingle-strandedoverhangfromtheinitialcut.第二十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日外源片段克隆到載體里的策略和步驟1、根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的載體；2、分析外源目的片段的酶切位點（找absentsite，分析軟件：如