臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：4 沉淀反應(yīng)、免疫電泳

沉淀反應(yīng)(precipitationreaction)概念：

可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)存在，兩者比例恰當(dāng)時(shí)，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀現(xiàn)象。

Ag沉淀原Ab

沉淀素(precipitin)實(shí)驗(yàn)中為使抗原抗體比例（數(shù)量）恰當(dāng)，應(yīng)稀釋Ag分類(lèi)：液體內(nèi)沉淀反應(yīng)：絮狀沉淀試驗(yàn)、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)免疫濁度測(cè)定法凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)：雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等凝膠免疫電泳：免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭免疫電泳等一.液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（一）絮狀沉淀反應(yīng)

(flocculation)抗原、抗體特異性結(jié)合，在電解質(zhì)存在的情況下出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的絮狀/塊狀沉淀既可在試管內(nèi)進(jìn)行，也可在玻片上進(jìn)行。用于：玻片法常用于定性測(cè)定

試管法:半定量測(cè)定在沉淀反應(yīng)前，應(yīng)測(cè)試抗原、抗體間最適比例，方法有抗原稀釋法、抗體稀釋法、方陣滴定等。方陣最適比測(cè)定抗體抗原稀釋度稀釋度———————————————————1/101/201/401/801/1601/3201/6401/1280對(duì)照

1/5++++++++++++±－－

1/10+++++++++++++－－

1/20++++++++++++－－

1/40－±++++++++++－

1/80－－－－++++－（二）環(huán)狀沉淀反應(yīng)方法：在環(huán)沉管（0.2×3cm)中進(jìn)行。

先加已知Ab，再加待測(cè)Ag。靜置30min后觀察Ag、Ab液面交界處是否有白色沉淀環(huán)，若有，為陽(yáng)性）。用途：用于微量抗原檢測(cè)（法醫(yī)學(xué)上血跡鑒定等）

環(huán)狀沉淀試驗(yàn)1.毛細(xì)玻管，內(nèi)徑1.5~2mm2.下層置血清（Ab），上層加Ag（不能顛倒）抗原、抗體相對(duì)應(yīng)，比例適當(dāng)，即形成沉淀環(huán)（三）免疫濁度測(cè)定(immunoturbidimetry)免疫濁度測(cè)定原理可溶性Ag與相應(yīng)Ab特異性結(jié)合，二者在比例合適及增濁劑PEG作用下，可快速形成AgAb復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。使用濁度計(jì)檢測(cè)相應(yīng)濁度，濁度高低與復(fù)合物含量成正比。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)濁度推算樣品中Ag含量。優(yōu)點(diǎn)：敏感、快速、定量測(cè)定

免疫濁度測(cè)定的影響因素Ag/Ab的比例：Ag/Ab比例合適是形成濁度的關(guān)鍵。

Ag過(guò)剩，形成的IC分子小，易發(fā)生再解離，使?jié)岫取?/p>

Ab過(guò)剩，出現(xiàn)前帶現(xiàn)象至等價(jià)帶Ab的質(zhì)量：特異性強(qiáng)（不出現(xiàn)交叉反應(yīng)）；效價(jià)高（＜1:20易產(chǎn)生非特異性濁度）；與Ag親和性強(qiáng)Ag/Ab反應(yīng)的環(huán)境：

合適的PH6.5~8.5；離子強(qiáng)度大（PBS作為反應(yīng)液）增濁劑（促聚劑）：PEG、Tween-20可促進(jìn)IC快速形成免疫比濁方法分類(lèi)

透射免疫比濁散射免疫比濁膠乳免疫比濁1.透射免疫比濁法原理：

緩沖液中，先加入已知過(guò)量Ab，然后加入待測(cè)Ag，AgAb復(fù)合物的量隨Ag量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可算出未知Ag含量。優(yōu)點(diǎn)：該法操作方便、檢測(cè)快速。臨床上多用于檢測(cè)IgG、IgA、IgM、C3、C反應(yīng)蛋白（CRP）等。缺點(diǎn)：所需Ag/Ab量大。

2.膠乳免疫比濁法原理：

將已知Ab吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)Ag時(shí)，使膠乳顆粒發(fā)生凝集，減少透光度。透光度減少程度與膠乳凝聚成正比，當(dāng)然也與Ag量成正比。本法不易選擇適用的乳膠，同時(shí)Ab與膠乳結(jié)合也困難。二.凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)

在凝膠介質(zhì)（瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠）中進(jìn)行的沉淀反應(yīng)原理

可溶性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在下，在瓊脂基質(zhì)中擴(kuò)散，當(dāng)兩者相遇，比例恰當(dāng)時(shí)結(jié)合，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線/沉淀環(huán)。（一）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

（簡(jiǎn)稱雙擴(kuò)

doubleimmunodiffusion)方法：制瓊脂板(3ml1.5%NS瓊脂）打孔（雙孔型/三角孔型/梅花孔型）加樣（平孔沿加滿）擴(kuò)散（37C、24h觀察結(jié)果）

雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原抗體抗原抗體結(jié)合沉淀線用途：1.已知Ag或Ab檢測(cè)未知Ab或Ag的濃度及分子量：雙孔型2.抗原性質(zhì)分析：三角孔型3.測(cè)Ag有效稀釋度或

Ab的效價(jià)：梅花孔型4.鑒定Ag或Ab純度：一條沉淀線，純；多條沉淀線，不純測(cè)未知抗原或抗體：雙孔型

抗原性質(zhì)分析：三角孔型

測(cè)Ag有效稀釋度：梅花孔型優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、易行，用途廣缺點(diǎn)：

敏感性低出結(jié)果慢只定性，不能精確定量（半定量）（二）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱單擴(kuò)

singleimmunodiffusion)方法：

已知定量Ab+瓊脂制板、打孔在瓊脂板小孔中加入待測(cè)的梯度AgAg向四周擴(kuò)散形成沉淀環(huán)

Ag濃度與沉淀環(huán)直徑呈線性關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出并計(jì)算待測(cè)標(biāo)本含量12345待測(cè)標(biāo)本單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)Ag的沉淀環(huán)注：1~5孔為抗原不同梯度形成的免疫沉淀環(huán)沉淀環(huán)直徑cmAg含量（濃度）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Ag濃度沉淀環(huán)直徑用途：定量測(cè)定抗原，如測(cè)IgG、IgA、IgM、C3等含量

三.免疫電泳技術(shù)(agargelimmunoelectrophoresis)在電場(chǎng)作用下進(jìn)行的凝膠擴(kuò)散電泳技術(shù)：帶電膠體顆粒在電場(chǎng)中向相反電極泳動(dòng)，利用電泳現(xiàn)象研究某些化學(xué)組分的分離技術(shù)免疫電泳技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：1.加快反應(yīng)速度2.規(guī)定了抗原、抗體擴(kuò)散方向，提高反應(yīng)敏感度3.可將某些帶電性不同的蛋白組分先分開(kāi)，再與抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)影響電泳的因素：1.與溶液的pH有關(guān)：常用pH8~9，蛋白質(zhì)帶負(fù)電2.與溶液離子強(qiáng)度有關(guān)：愈高，泳動(dòng)慢，一般0.02~0.2M3.與電場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)：愈高，愈快，一般4~6v/cm（瓊脂長(zhǎng)），約40v左右4.電滲作用的影響電滲作用：電場(chǎng)中液體對(duì)于一固體的固定相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象。電滲方向與電泳方向相反。

（一）對(duì)流免疫電泳（counter-immunoelectrophoresis)原理：定向加速的免疫雙擴(kuò)

（雙擴(kuò)＋電場(chǎng)，使抗原、抗體相對(duì)泳動(dòng)）方法：

抗原、抗體分別在瓊脂板上不同孔內(nèi)，抗原在負(fù)極端，抗體在正極端，電泳。電壓：4~6v/cm(瓊脂長(zhǎng)度）電泳時(shí)間：45分鐘~1小時(shí)-抗原抗體對(duì)流免疫電泳PH：8.6BB緩沖液

Ag：-，借助電泳由負(fù)向正極運(yùn)動(dòng)；

Ab：-少，分子大，重，電泳慢，因電滲反而由正向負(fù)極運(yùn)動(dòng)。優(yōu)點(diǎn)、用途：

簡(jiǎn)便、快速；反應(yīng)敏感度達(dá)μg/ml

常用于Ag/Ab的效價(jià)及純度鑒定（二）火箭免疫電泳（rocketimmunoelectrophoresis)原理：

單擴(kuò)＋電場(chǎng)，為定量試驗(yàn)方法：

已知定量Ab+瓊脂混合，制板在玻板一端打孔、加梯度Ag

電泳根據(jù)所知樣品梯度含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

查出待測(cè)樣品含量-+火箭免疫電泳12345待測(cè)優(yōu)點(diǎn)與用途：

與單擴(kuò)相同，已知Ab定量檢測(cè)Ag（IgG/IgA/IgM），時(shí)間短，敏感度高（ng/ml）。（三）免疫電泳（immunoelectrophoresis)

多用于分析復(fù)雜抗原組分原理：

Ag區(qū)帶電泳＋雙擴(kuò)結(jié)合方法：

1.Ag電泳分出區(qū)帶

2.Ag、Ab免疫雙擴(kuò)用途：常用于分析復(fù)雜Ag的組分。（如人全血清組分的分析）-+病人血清中缺少這條沉淀線雙擴(kuò)時(shí)加Ab的小槽人血清免疫電泳后的結(jié)果（有的病人缺少某一條沉淀線，有的病人會(huì)出現(xiàn)多一條不該有的沉淀線，均為異常）正常人血清病人血清優(yōu)點(diǎn)：

用樣品量小特異性高分辨力強(qiáng)缺點(diǎn)：

由于復(fù)雜抗原中各成分含量差異大，不能全部顯出，敏感性不高。用途：

分析復(fù)雜抗原組分