關(guān)于慢病毒感染的相關(guān)知識總結(jié)

..慢病毒使用操作手冊一、慢病毒的儲存與稀釋:

1.

病毒的儲存：收到病毒液后在很短時間內(nèi)即使用慢病毒進(jìn)行實驗,可以將病毒暫時放置于4℃保存；如需長期保存請放置于-80℃〔病毒置于凍存管,并使用封口膜封口

①

病毒可以存放于-80℃6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月,建議在使用前需要重新滴定病毒滴度

②反復(fù)凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過程中應(yīng)僅盡量避免反復(fù)凍融,為避免反復(fù)凍融,建議收到病毒后按照每次的使用量進(jìn)行分裝。

2.

病毒的稀釋：如果需要稀釋病毒,請將病毒取出置于冰浴融解后,使用培養(yǎng)目的細(xì)胞用PBS或無血清培養(yǎng)基<含血清或含雙抗不影響病毒感染>?；靹蚍盅b后4℃保存<請盡量在三天內(nèi)用完>分裝后使用。

二、慢病毒用于體外〔InVitro實驗：

感染培養(yǎng)原代細(xì)胞和建系細(xì)胞。慢病毒對各種細(xì)胞和組織的親嗜性不同,在使用慢病毒之前可以通過查閱相關(guān)文獻(xiàn),了解慢病毒對您的目的細(xì)胞的親嗜性,感染復(fù)數(shù)〔MOI值以及在體〔InVivo注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持,可以通過感染預(yù)實驗得到合適的感染復(fù)數(shù)〔MOI值〔使用24孔板檢測病毒對目的細(xì)胞的親嗜性。

慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實驗

1.

慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實驗注意事項：

①測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時,需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞<HEK293T,Hela作為平行實驗的對照細(xì)胞。

②在進(jìn)行慢病毒感染實驗時,可以用完全培養(yǎng)基〔培養(yǎng)目的細(xì)胞用稀釋；理論上,含有血清,雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。

③一般慢病毒單位為TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如：病毒滴度為>1X108TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108個具有生物活性的慢病毒顆粒。

2.

以24孔培養(yǎng)板為例,進(jìn)行目的細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞的感染預(yù)實驗實驗前按照不同的MOI設(shè)置不同的感染孔,并根據(jù)MOI和細(xì)胞數(shù)量計算所需要的病毒量,如有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液。

第一天,準(zhǔn)備細(xì)胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔,每個孔內(nèi)接種3~5X104個目的細(xì)胞,鋪板時細(xì)胞的融合率為50%左右,每孔培養(yǎng)基體積為100μl；進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度約為70%左右。

第二天,準(zhǔn)備病毒：取出4℃保存的病毒,使用臺式離心機(jī)離心20秒〔使病毒完全懸于離心管底部即可；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實驗室的實際情況將按照MOI準(zhǔn)確計算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中,并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積,以期獲得最佳的感染效率。

第二天,感染目的細(xì)胞：病毒準(zhǔn)備好之后,從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞,首先察細(xì)胞生長狀態(tài),如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實驗。

a使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基。

b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基〔如果細(xì)胞生長良好,密度適宜,則不用換液。

c在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計算好的病毒液。

d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱〔37℃、5%CO2孵育過夜。

注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大,所以務(wù)必保證加病毒之前細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。亦可以將預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng)器皿中。慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低,通過提高M(jìn)OI值可以提高病毒的感染效率,但是當(dāng)MOI高于20時,我們建議在培養(yǎng)基中加入ploybrene〔8μg/ml左右來提高病毒的感染效率。

第三天,更換培養(yǎng)液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在感染后觀察細(xì)胞狀態(tài),如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用而影響細(xì)胞生長狀態(tài),可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)〔建議在8-12小時更換為宜。第一次換液后,如果慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用,按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。

第六天,感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光,估計慢病毒感染目的細(xì)胞的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶MarkerGene的,可以通過Real-timeRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)來拍評估感染效率。

注意：

有些慢病毒載體上帶有GFP綠色熒光蛋白,使用者可以在病毒感染96小時后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光,以觀察病毒對目的細(xì)胞的感染情況。如果慢病毒載體攜帶其他MarkerGene如RFP\BFP可以用熒光顯微鏡在對應(yīng)的激發(fā)光波長下觀察熒光表達(dá)的情況。

慢病毒表達(dá)時間較慢,熒光表達(dá)所需時間較長,建議感染后96小時后觀測熒光表達(dá)。

感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周,通過觀察熒光的表達(dá)時間和表達(dá)強(qiáng)度來確定慢病毒對目的細(xì)胞的感染情況。感染期間請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行及時換液,以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。

三、慢病毒使用安全使用規(guī)范

慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學(xué)危險,不建議使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經(jīng)完全公認(rèn)某個基因肯定沒有致癌性,否則均不建議采用假型病毒進(jìn)行生物學(xué)實驗。使用時請參照如下所示進(jìn)行實驗：

1．病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒,請不要打開排風(fēng)機(jī)。

2．病毒操作時請穿實驗服,帶口罩和手套。

3．操作病毒時特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒污染,請立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭,離心管,培養(yǎng)板,培養(yǎng)液請于84消毒液或1%SDS中浸泡過夜后棄去。

4．用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。用70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實驗臺之前,用70%乙醇清理顯微鏡實驗臺。

5．如需要離心,應(yīng)使用密封性好的離心管,或者用封口膜封口后離心,而且盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。

6．脫掉手套后,用肥皂和水清洗雙手。四、懸浮細(xì)胞感染方法概要

1.

根據(jù)細(xì)胞的量將細(xì)胞在1.5ml管中離心收集然后用100-200ul的無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀,以細(xì)胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準(zhǔn)。

2.

按照MOI換算病毒顆粒數(shù)量,吸取病毒液加入細(xì)胞中,將1.5ml管放在37℃度培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。

3.

將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里。

4.

加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液。

5.

12小時后換液。

6.

96小時后觀察細(xì)胞陽性率。五、相關(guān)專業(yè)術(shù)語：MOI：病毒感染復(fù)數(shù)傳統(tǒng)的MOI概念起源于噬菌體感染細(xì)菌的研究。其含義是感染時噬菌體與細(xì)菌的數(shù)量比值,也就是平均每個細(xì)菌感染噬菌體的數(shù)量。噬菌體的數(shù)量單位為pfu。一般認(rèn)為MOI是一個比值,沒有單位,其實其隱含的單位是pfunumber/cell。后來MOI被普遍用于病毒感染細(xì)胞的研究中,含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值,本手冊中提到的MOI都是沿用這個概念。然而,由于病毒的數(shù)量單位有不同的表示方式,從而使MOI產(chǎn)生了不同的含義。能產(chǎn)生細(xì)胞裂解效應(yīng)的病毒例如單純皰疹病毒等習(xí)慣上仍用pfu表示病毒數(shù)量,因此其MOI的含義與傳統(tǒng)的概念相同。

六、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù)Flask/DishSurface<mm>CellnumberMediaVolume96wellplate501.5-5.0×10100μl48wellplate1003.0×104-1.0×10200μl24wellplate2008.0×104-2.0×10500μl12wellplate4011.6-4.0×101.0ml6wellplate9623.0-8.0×102.0ml35mm9623.0-8.0×102.0ml60mm28271.0-2.5×10

6.0ml100mm78542.5-6.4×1010.0ml慢病毒重組慢病毒簡介在轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)到細(xì)胞基因組中的工作中,重組慢病毒載體是一個強(qiáng)大和有效的工具。慢病毒能作用于細(xì)胞周期的G0/G1期,同時具有嗜核性,所以可以感染分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞,感染包括幾乎所有的哺乳動物細(xì)胞、干細(xì)胞和原代培養(yǎng)的細(xì)胞。慢病毒載體具有攜帶基因片段容量大、轉(zhuǎn)染效率高、可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、目的基因可在宿主細(xì)胞中長時間穩(wěn)定表達(dá)以及安全性好、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點。所以獲得了較廣的應(yīng)用范圍。慢病毒載體也是RNAi表達(dá)的主要手段,同化學(xué)合成和酶切形成的siRNA相比具有幾個優(yōu)點：其一,可以攜帶GFP或螢光素酶等報告基因共表達(dá),便于跟蹤、選擇和富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；其二,可以根據(jù)需要表達(dá)不同類型的小RNA分子〔siRNA、shRNA或miRNA；其三,具有較高的轉(zhuǎn)染效率,使基因沉默維持較長時間。目前Pubmed中收錄有關(guān)慢病毒載體用作實驗的文章超過7萬多篇,僅Nature,,Science,,Cell上便超過600篇。已成為國際上最通用的轉(zhuǎn)染系統(tǒng),廣泛用于各類實驗室。慢病毒的安全操作規(guī)范XX百恩維提供的慢病毒均采用第三代系統(tǒng)的慢病毒載體。水泡性口炎病毒來源的VSV-G基因代替HIV-1的env基因,這既提高了慢病毒的安全性,又使其能夠感染的細(xì)胞種類大大增加。本系統(tǒng)的慢病毒顆粒是"自身失活型<SIV>",整合入靶細(xì)胞后,不會產(chǎn)生完整長度的RNA,僅僅具有攜帶目的基因的功能,感染目的細(xì)胞后不再感染其他細(xì)胞,也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。盡管如此,該病毒仍然具有潛在的生物學(xué)危險性,因此建議不要使用編碼已知或可能會致癌的基因的假性病毒；并強(qiáng)烈建議將本系統(tǒng)生產(chǎn)的慢病毒視為二級生物安全水平的生物,而且嚴(yán)格遵守BSL-2或BSL-2+操作手冊并進(jìn)行相應(yīng)的廢棄物消毒?；静僮饕?guī)范如下：1、在實驗室工作時,任何時候都必須穿著連體衣、隔離服或工作服；應(yīng)戴上合適的手套和口罩。2、病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通的超凈工作臺操作病毒,請不要打開風(fēng)機(jī)。3、所有的技術(shù)操作要按盡量減少氣溶膠和微小液滴形成的方式來進(jìn)行。如果出現(xiàn)病毒污染,請立即用70%的酒精加1%SDS溶液擦拭干凈。4、如需離心,應(yīng)使用密封性好的離心管,可用Parafilm膜封口后離心,而且最好使用組織或細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。5、用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板,并在使用70%乙醇清理所有受到污染的材料、標(biāo)本和培養(yǎng)物在廢棄或清潔再利用之前,必須清除污染。廢棄的含病毒的培養(yǎng)基加入84消毒液〔1:20左右,浸泡一天后丟棄。接觸過病毒的槍頭,離心管,培養(yǎng)板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理,也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌〔121℃,30min。6、手套用完后,應(yīng)先消毒再摘除,隨后必須洗手。詳細(xì)操作規(guī)范請參閱衛(wèi)生部發(fā)布的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》〔WS233-2002、美國疾病控制中心出版的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗生物安全〔第五版》和世界衛(wèi)生組織出版《WHO生物安全手冊》。操作慢病毒時請依照現(xiàn)有的使用指南。包裝細(xì)胞293T細(xì)胞〔下述流程來自XX百恩維,如果使用不同公司系統(tǒng)請參考各公司提供的方案,本流程僅供參考293T細(xì)胞的凍存1、隨著傳代的次數(shù)增加,293T細(xì)胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降,出現(xiàn)突變等,所以要在細(xì)胞購進(jìn)時就進(jìn)行備份。2、在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行凍存,增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。3、倒去細(xì)胞上清液,加入D-Hank's液洗去殘留的培養(yǎng)基。4、加入0.25%的胰酶,消化10-20s后倒去。5、鏡下觀察細(xì)胞變圓,細(xì)胞間間隙加大時,加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。6、細(xì)胞計數(shù)。7、將細(xì)胞離心,1000rpm,2min。8、根據(jù)計數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液〔70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO重懸細(xì)胞,密度為3×106個/ml。10、第二天將細(xì)胞放入液氮灌,并記錄。293T細(xì)胞的傳代1、當(dāng)細(xì)胞生長至匯合率達(dá)到80~90%需要對細(xì)胞進(jìn)行傳代操作,以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量,維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。2、消化細(xì)胞,方法同上。3、細(xì)胞離心結(jié)束后,加入完全培養(yǎng)基重懸。密度為3×105個/ml。4、分到10cm培養(yǎng)皿中,10ml/皿。293T細(xì)胞的復(fù)蘇1、當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多〔超過50代,細(xì)胞狀態(tài)變差時或細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時,需要丟棄并對開始凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。2、打開水浴鍋,設(shè)置溫度為37℃。3、查看細(xì)胞庫記錄,根據(jù)記錄從液氮灌中取出凍存的細(xì)胞〔需戴上棉手套,防止被凍傷,迅速丟入水浴鍋中并快速晃動,在1~2min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。4、將1ml細(xì)胞溶液加入9ml完全培養(yǎng)基中并混勻后轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿。5、放回37℃、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細(xì)胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基,加入10ml新鮮培養(yǎng)基。慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定1、所用病毒檢測引物為WPRE特異引物,序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'<forwardprimer>,5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'<reverseprimer>and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'<probe>2、TaqManUniversalPCRMasterMix<AppliedBiosystems,

cat.no.4304437>3、TaqManDNATemplateReagentKit<AppliedBiosystems,

cat.no.401970>4、TaqManRNasePcontrolreagent<AppliedBiosystems,

cat.no.4316844>

用于包裝的293T細(xì)胞<ATCCNo.CRL-11268>必需選擇處于生長旺盛期,細(xì)胞狀態(tài)較佳,存活率90%以上,細(xì)胞邊緣清晰,傳代次數(shù)較低。任何時候細(xì)胞匯合率都不準(zhǔn)達(dá)到100%。慢病毒的包裝1、預(yù)先準(zhǔn)備3個T150瓶的293T細(xì)胞,培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS,1%Glutamax

,1%

青霉素-鏈霉素。2、將細(xì)胞分到12個T150瓶中,每瓶的細(xì)胞密度是8×106個。3、第二天,鏡下檢查細(xì)胞。細(xì)胞融合度應(yīng)大致為30-40%,分布均勻。4、轉(zhuǎn)染前1小時,取出細(xì)胞板,去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基,加入20ml的Opti-MEM培養(yǎng)基,將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱。5、取兩支無菌的50ml離心管,其中一支中加入252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3

載體質(zhì)粒,168μgpCD/NL-BH*DDD

包裝質(zhì)粒和84μgpLTR-G質(zhì)粒,用Opti-MEM培養(yǎng)基補(bǔ)齊到18ml。另一支中加入500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培養(yǎng)基,用電動移液器輕輕混勻。將Trans-EZ稀釋液滴加到質(zhì)粒管中,邊加邊輕輕晃勻。關(guān)鍵步驟：推薦使用Qiagen質(zhì)粒大抽試劑盒或相當(dāng)?shù)脑噭┖兴苽涞馁|(zhì)粒。6、室溫孵育20分鐘,使DNA和Trans-EZ充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。7、取1支5ml的移液管,將得到的DNA-Trans-EZ復(fù)合體均勻滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中,每板3ml。來回晃動培養(yǎng)板,混勻后放回到5%二氧化碳培養(yǎng)箱。每一皿細(xì)胞培養(yǎng)盤不要超過6盤。8、6小時后,移去細(xì)胞上清,更換為17ml的DMEM完全培養(yǎng)基。9、轉(zhuǎn)染后一天觀察細(xì)胞,所有的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)都是健康的并且密度接近60-80%。如果所轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有GFP熒光,那么這時候可以看到大于95%的細(xì)胞都是帶有熒光的。10、將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天〔36-48小時。在這個過程中,細(xì)胞會逐漸融合形成多核體,大多數(shù)的細(xì)胞依然貼壁。11、收集所有的上清,分裝到50ml離心管中。12、4℃,500g離心10分鐘,除去脫落的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片。13、總的上清約為204ml,用250-ml0.45μmPVDF過濾裝置過濾。如果發(fā)現(xiàn)濾膜被堵住,表現(xiàn)為過濾速度變慢,更換新的濾器。慢病毒的濃縮與純化方法一：超速離心沉淀法1、取6個Ultra-clearSW28離心管,用70%乙醇消毒后,放在超凈工作臺中打開紫外燈繼續(xù)消毒30分鐘。2、每個Ultra-clearSW28離心管中加入約32ml的預(yù)先處理的病毒上清液。3、取一支10ml的移液管,吸取12ml20%的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部,緩慢將蔗糖溶液打出4ml。同樣地,將剩下8ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個離心管中。另取一支干凈的移液管,對剩下3管進(jìn)行同樣處理。4、用PBS調(diào)整各管的重量,使對應(yīng)的離心管之間的重量相差不超過0.1g。5、按次序?qū)⑺?個離心管放入BeckmanSW28

超速離心轉(zhuǎn)頭中。6、小心將管子從轉(zhuǎn)頭中取出。倒掉上清,將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應(yīng)當(dāng)有可見的沉淀。7、每管中加入100ml

不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀。8、將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中,蓋上蓋子。9、在4℃溶解2小時,每隔20分鐘輕輕震蕩。10、4℃,500g離心1分鐘,使溶液集中于管底。11、用200μl

移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中。12、集中后的病毒懸液分裝成50μl

每份,保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80℃。方法二

PEG-8000濃縮法5XPEG8000+NaCl配制稱取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q純水中；121攝氏度

30min

濕熱滅絕

30min；保存在4℃。1、使用0.45μm濾頭過濾慢病毒上清液；2、每20～30min混合一次,共進(jìn)行3-5次；3、4度放置過夜；4、4度,4000g,離心

20min；5、吸棄上清,靜置管子1～2分鐘,吸走殘余液體；6、加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；7、集中后的病毒懸液分裝成50μl每份,保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80℃病毒滴度的測定稀釋計數(shù)法滴度單位：TU/ml,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。"TU"為"transducingunits"的縮寫,中文為"轉(zhuǎn)導(dǎo)單位",表示可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。第一天細(xì)胞準(zhǔn)備將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至1×105/ml,加入96孔板,100μl/孔,為每個病毒準(zhǔn)備10個孔。放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀釋,連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn)備10個1.5mlEP管,每管加入90μl培養(yǎng)液,往第一個管中加入10μl病毒原液,混勻后,吸取10μl加入第二個管混勻。依此類推,做十個稀釋度〔10~10-8。吸取96孔板中原有的培養(yǎng)基,加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。第三天追加培養(yǎng)液在每個孔再加入100μl完全培養(yǎng)液,利于細(xì)胞的生長。第五天觀察結(jié)果并計算滴度在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y,則滴度〔TU/ml=〔X+Y*10*1000/2/X孔的病毒液的含量〔μl。定量PCR法病毒感染1天前,取6孔板接種HOS細(xì)胞,每孔細(xì)胞為5×104個。接種細(xì)胞24小時后,取兩個孔的細(xì)胞用血球計數(shù)板計數(shù),確定感染時細(xì)胞的實際數(shù)目,記為N。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,更換為含有5μg/mlpolybrene的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋200倍,也就是取1μl病毒加入到199μl的培養(yǎng)基中。在3個培養(yǎng)孔中分別加入0.5μl,5μl和50μl的稀釋病毒。感染開始后20小時,除去培養(yǎng)上清,換為500μl含DNaseI<TakaraMirusBio,終濃度為10U/ml>的新鮮培養(yǎng)基。在37℃消化15分鐘,這一步是要除去殘余的質(zhì)粒DNA。然后換為2ml正常的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48小時。用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞,在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下,離心收集細(xì)胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200μl洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量〔Bio-Rad?；蚪MDNA可以穩(wěn)定保存在-20℃至少2個月。準(zhǔn)備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管Ⅰ：2×TaqManMasterMix25μl×nForwardprimer<100pmolml-1>0.1μl×nReverseprimer<100pmolml-1>0.1μl×nProbe<100pmolml-1>0.1μl×nH2O19.7μl×nn=numberofreactions.

例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix,4μlforwardprimer,4μlreverseprimer,4μlprobe

和788μlH2O混和。震蕩后放在冰上。為人基因組序列檢測引物配總管Ⅱ：2×TaqManMasterMix25μl×n10×RNasePprimer/probemix2.5μl×nH2O17.5μl×nn=numberofreactions.

例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix,100μl10×RNasePprimer/probemix和700μlH2O混和。震蕩后放在冰上。在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中,從總管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。分別取5μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中,每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照〔no-templatecontrol。分別取5μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組DNA加入到E-G行中,每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照〔no-templatecontrol。所使用定量PCR儀為ABIPRISM7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：

50℃2分鐘,95℃10分鐘,然后是95℃15秒,60℃1分鐘的40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定,得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度〔integrationunitsperml,IUml-1的計算公式如下：IUml-1=<C×N×D×1000>/V其中：

C=

平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)

N=

感染時細(xì)胞的數(shù)目〔約為1×105

D=

病毒載體的稀釋倍數(shù)

V=

加入的稀釋病毒的體積數(shù)慢病毒的儲存與稀釋慢病毒的儲存1、病毒的運輸采用干冰保溫,收到病毒液后若幾天內(nèi)用于實驗,可于4℃保存〔于一周內(nèi)用完。2、若病毒量較大,需長期保存。則根據(jù)每次實驗用量分裝后放于-80℃冰箱。一般病毒可以放于-80℃約12個月以上,但若超過6個月后使用,請重新檢測病毒滴度。3、避免反復(fù)凍融,否則會降低病毒滴度。每次凍融會降低病毒滴度10%。慢病毒的稀釋需要稀釋病毒時,將病毒取出后置于冰上融解,用細(xì)胞培養(yǎng)用D-Hank's、PBS或培養(yǎng)基稀釋到所需濃度后混勻分裝后4℃保存,并盡快用于實驗〔于一周內(nèi)用完。慢病毒在細(xì)胞水平的使用什么是MOI？"MOI"為"multiplicityofinfection"的縮寫,中文為"感染復(fù)數(shù)"或"復(fù)感染指數(shù)",含義為感染時病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值,即平均每個細(xì)胞感染的病毒活性單位數(shù)〔TUnumber/cell。在實驗中將某種細(xì)胞感染達(dá)到80%時的MOI定義為這種細(xì)胞的MOI。MOI與整合事件以及目的基因的表達(dá)相關(guān)。一定范圍內(nèi),表達(dá)水平和MOI呈正相關(guān)。MOI取決于多種因素,如細(xì)胞狀態(tài),目的基因的大小與性質(zhì),細(xì)胞的感染效率等。所以,實驗前需查閱相關(guān)文獻(xiàn),確定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性、MOI以及在體〔invivo注射所需病毒量。若無文獻(xiàn)支持,可以通過預(yù)實驗得到合適的MOI。實際上,即使有文獻(xiàn)支持,但由于所用細(xì)胞代數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)以及目的基因的差異,實際的MOI和文獻(xiàn)報道也會不同,所以要安排預(yù)實驗以確定所需MOI以及病毒對細(xì)胞生長的影響。目的細(xì)胞感染預(yù)實驗及實驗體系的放大實驗?zāi)康模捍_定細(xì)胞感染所需的MOI,以及是否需要添加感染增強(qiáng)劑Polybrene。實驗材料：96孔板,1.5mlEP管,長勢良好的目的細(xì)胞一瓶,已知滴度的慢病毒溶液,Polybrene〔10mg/ml,目的細(xì)胞培養(yǎng)基等。第一天：細(xì)胞準(zhǔn)備將長勢良好的目的細(xì)胞接種到96板,消化好細(xì)胞〔懸浮細(xì)胞不需要消化,直接離心收集細(xì)胞后加新鮮培養(yǎng)基重懸即可后把濃度調(diào)為3×104~5×104個/ml,按90μl/孔加入。接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長