植物組織培養(yǎng)褐變產(chǎn)生的因素及對(duì)策

植物組織培養(yǎng)褐變產(chǎn)生的因素及對(duì)策褐變?cè)谠S多植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，常遇到褐變問(wèn)題。褐變主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細(xì)胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對(duì)許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)與分化，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡。本文探討植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的影響因素、機(jī)理及防范措施，對(duì)我們進(jìn)行科學(xué)研究或工廠生產(chǎn)，包括植物組織的培養(yǎng)原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞和植物器官的培養(yǎng)都有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。1、褐變的危害褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中，自身組織從表面培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物數(shù)量多少及多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細(xì)胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。在切割外植體時(shí)，切口附近的細(xì)胞受到傷害，其分割狀態(tài)被打破，酚類化合物外溢。對(duì)于外植體本身來(lái)講，酚類物質(zhì)從外植體切口向外溢出是一種自我保護(hù)性反應(yīng)，可誘導(dǎo)植保素或無(wú)物理屏障的形成，以防止微生物浸染組織。但酚類很不穩(wěn)定，在溢出過(guò)程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又會(huì)在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進(jìn)一步引起其他酶系統(tǒng)失活。從而導(dǎo)致組織代謝活動(dòng)紊亂，生長(zhǎng)停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會(huì)使多酚氧化酶激活而引起褐變。2、褐變產(chǎn)生的機(jī)理非酶促褐變非酶促褐變是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。將生長(zhǎng)正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培養(yǎng)基中，組織周圍尤其是接觸培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒(méi)有看到擴(kuò)散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度升高時(shí)繼代保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)發(fā)生此類現(xiàn)象但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了酶促褐變目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的。酶促褐變?nèi)缤话愕拿复俜磻?yīng)，其發(fā)生必須具備三個(gè)條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶PPO、過(guò)氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過(guò)程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來(lái)看，表明PPO活性的高低是引起培養(yǎng)材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成三類:苯基羧酸，苯丙烷衍生物，黃烷衍生物，但并非所有的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。在正常發(fā)育的植物組織中底物、氧氣、PPO同時(shí)存在并不發(fā)生褐變，是因?yàn)樵谡５慕M織細(xì)胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時(shí)，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。3、褐變產(chǎn)生的影響因素影響植物組織培養(yǎng)褐變的因子是復(fù)雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。植物種類及基因型在不同植物或同種植物不同基因型的組培過(guò)程中，褐變發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度存在很大的差異，這是由于各種植物所含的單寧及其他酚類化合物的數(shù)量不同。一般木本植物的酚類化合物含量比草本植物高，更易發(fā)生褐變現(xiàn)象。核桃的單寧含量很高，不僅在接種初期發(fā)生褐變，在形成愈傷組織后還會(huì)因?yàn)楹肿兌劳?；蘋(píng)果進(jìn)行莖尖培養(yǎng)時(shí)，不同品種之間褐變的程度也不一樣。對(duì)葡萄的研究也發(fā)現(xiàn)類似情況。外植體的生理狀態(tài)外植體的生理狀態(tài)不同，接種后褐變程度不同。一般外植體的老化程度越高，其木質(zhì)素的含量也越高，也就越容易褐變，成齡材料一般均比幼齡材料褐變嚴(yán)重。另外切口越大，酚類物質(zhì)的被氧化面也越大，褐變程度就會(huì)更嚴(yán)重。因此外植體的受傷程度對(duì)褐變的產(chǎn)生具有明顯的影響，傷口加劇褐變的發(fā)生。仙客來(lái)小葉誘導(dǎo)時(shí)，整片葉接種較分成多塊褐變要輕。除機(jī)械損傷外，各種消毒劑對(duì)外植體的傷害也會(huì)引起褐變，對(duì)于不易褐變的種類，用升汞消毒后，一般不會(huì)引起褐變，若用次氯酸鈉進(jìn)行消毒，則很容易引起褐變的發(fā)生。取材時(shí)間和部位在不同的生長(zhǎng)季節(jié)，植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。實(shí)驗(yàn)表明在蘋(píng)果和核桃上，冬、春季取材褐變死亡率最低，夏季取材很容易褐變。在取材部位上幼嫩莖尖比其他部位褐變程度低，木質(zhì)化程度高的節(jié)段在進(jìn)行藥劑消毒處理后褐變現(xiàn)象更為嚴(yán)重。培養(yǎng)基在初代培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高，會(huì)引起酚類物質(zhì)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致褐變。BA和KT不僅促進(jìn)酚類化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐變；而生長(zhǎng)素類如NAA和2，4-D可延緩多酚合成，減輕褐變。采用液體培養(yǎng)基紙橋培養(yǎng)；可使外植體溢出的有毒物質(zhì)很快擴(kuò)散到液體培養(yǎng)基中，效果也很好。光照在采取外植體前，如果將材料或母株枝條進(jìn)行遮光處理，然后再切取外植體培養(yǎng)，能夠有效地抑制褐變的發(fā)生。將接種后的初代培養(yǎng)材料在黑暗條件下培養(yǎng)，對(duì)抑制褐變發(fā)生也有一定的效果遮光抑制褐變的原因主要是由于氧化過(guò)程中，許多反應(yīng)受酶系統(tǒng)控制，而酶系統(tǒng)活性受光照影響。但是，暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低外植體的生活能力，甚至引起死亡。溫度高溫促進(jìn)酚氧化，培養(yǎng)溫度越高，褐變?cè)絿?yán)重，而低溫可抑制酚類化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，從而減輕褐變。在15-25°C下培養(yǎng)卡特蘭，比在25°C以上時(shí)褐變要輕，在17C以下培養(yǎng)天竺葵莖尖比在17-27C褐變要輕。培養(yǎng)時(shí)間材料培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起褐變物的積累，加重對(duì)培養(yǎng)材料的傷害。蝴蝶蘭、香蕉等隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褐變程度會(huì)加劇，甚至在超過(guò)一定時(shí)間不進(jìn)行轉(zhuǎn)接，褐變物的積累還會(huì)引起培養(yǎng)材料的死亡。4、抑制褐變的措施從理論上講酶促褐變可以通過(guò)以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧；二是捕捉或減少聚合反應(yīng)的中間產(chǎn)物；三是抑制有關(guān)的酶。實(shí)際操作上，下列措施是被認(rèn)為行之有效的。選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w取材時(shí)應(yīng)注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴(yán)重。冬季的芽不易生長(zhǎng)，宜選用早春和秋季的材料作5為外植體。王異星用荔枝無(wú)菌苗不同組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)表明，莖最容易誘導(dǎo)出愈傷組織，培養(yǎng)2周后長(zhǎng)出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導(dǎo)出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織全部褐變。對(duì)外植體的處理通過(guò)對(duì)較易褐變的外植體材料的預(yù)處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5C的低溫下處理12-24小時(shí)，再用升汞或70酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中。取出外植體用0.1漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中。若仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基2-3次，當(dāng)外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。用抗壞血酸預(yù)處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導(dǎo)率。適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關(guān)，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型。添加褐變抑制劑和吸附劑褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚。由于其作用過(guò)程均為消耗性的，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對(duì)外植體無(wú)毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細(xì)胞的培養(yǎng)基中，添加植酸PA,可防止PA褐變，分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等在對(duì)植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究中也證實(shí)了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP。活性炭是一種吸附性較強(qiáng)的無(wú)機(jī)吸附劑，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中分泌的酚醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等從而有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強(qiáng)，一般在培養(yǎng)基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過(guò)程中應(yīng)注意，盡量用最低濃度的活性炭來(lái)對(duì)抗褐變的產(chǎn)生，因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菦](méi)有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對(duì)外植體的誘導(dǎo)分化會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。而聚乙烯吡咯烷酮PVP是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細(xì)胞器的保護(hù)劑，可用于防止褐變。進(jìn)行細(xì)胞篩選和多次轉(zhuǎn)移在組織培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)常進(jìn)行細(xì)胞篩選，可以剔除易褐變的細(xì)胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問(wèn)題。其他措施在外植體接種后1-2天即轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中或同一培養(yǎng)基的不同部位，