毛細(xì)管電泳的主要分離模式 免費(fèi)

常用分離模式毛細(xì)管電泳是指所有在極細(xì)毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行的電泳新技術(shù)，它根據(jù)分離機(jī)理不同具有多種分離模式，能夠提供互不相關(guān)而又相互補(bǔ)充的信息。毛細(xì)管電泳常用的分離模式包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）或稱自由溶液毛細(xì)管電泳（FSCE）、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）、毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）、毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）和毛細(xì)管等速電泳（CITP）,各分離模式、分離機(jī)理見下表。在大多數(shù)情況下，可以通過(guò)改變緩沖液的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)不同的操作模式。毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）是毛細(xì)管電泳中最簡(jiǎn)單、最基本、應(yīng)用最廣泛的一種分離模式。在毛細(xì)管中僅填充緩沖液，基于溶質(zhì)組分的遷移時(shí)間或淌度的不同而分離。除了溶質(zhì)組分本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和緩沖液組成，不存在其他因素如聚合物網(wǎng)絡(luò)、pH梯度或另一分配相對(duì)分離的影響。CZE分離無(wú)需固體支持介質(zhì)，不存在基質(zhì)效應(yīng)，能分離淌度差別很小的組分。CZE中由于電滲流的存在，陰、陽(yáng)離子可以同時(shí)分析，中性溶質(zhì)電泳遷移為零與電滲流同時(shí)流出，如下圖。CZE的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、分離效率高，應(yīng)用范圍廣。從原理上講可以適用于所有具有不同淌度的荷電粒子的分離，分子量范圍從十幾的小分子離子到幾十萬(wàn)的生物大分子。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC或MEKC）是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)巧妙結(jié)合的分離新技術(shù)。MECC是在電泳分離緩沖液中加人離子型表面活性劑膠束，使電中性物質(zhì)能根據(jù)其在膠束相和水相的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離。MECC是毛細(xì)管電泳中唯一能同時(shí)分離中性物質(zhì)和離子型物質(zhì)的分離模式。它是1984年由Terabe首先報(bào)道的一種新型的毛細(xì)管電泳技術(shù)，也是目前研究較多，應(yīng)用較廣的一種毛細(xì)管電泳操作模式。MECC是基于膠束增溶和電遷移過(guò)程進(jìn)行的，因此其分離要求有兩相：一相是帶電的離子膠束，是不固定在毛細(xì)管中的假固定相，它具有與周圍緩沖液介質(zhì)不同的電泳淌度，也可稱為膠束電泳淌度（綣丿，并且與分離溶質(zhì)相互作用（膠束增溶過(guò)程）；另一相是導(dǎo)電的水溶液相，在電場(chǎng)作用下，水相由電滲流驅(qū)動(dòng)流向陰極（電遷移過(guò)程）。對(duì)于常用的十二烷基硫酸鈉（SDS）膠束，因其表面帶負(fù)電荷，泳動(dòng)方向與電滲流相反，朝陽(yáng)極方向泳動(dòng)。在緩沖液pH>5時(shí)，電滲流速度大于膠束電泳速度，所以膠束的實(shí)際移動(dòng)方向和電滲流相同，都向陰極移動(dòng)。中性溶質(zhì)基于色譜分配原理，在以電滲流驅(qū)動(dòng)的水溶液相和膠束相之間進(jìn)行分配，疏水性較強(qiáng)的溶質(zhì)與膠束的作用較強(qiáng)，結(jié)合到膠束中的溶質(zhì)較多也較穩(wěn)定，相對(duì)于疏水性較弱的溶質(zhì)遷移較慢，未結(jié)合的溶質(zhì)則隨電滲流流出。因此，中性溶質(zhì)按其疏水性不同在兩相間的分配系數(shù)不同而得到分離，下圖是MECC的分離原理示意圖。MECC實(shí)際是一種區(qū)帶電泳技術(shù)，只是用離子膠束溶液代替CZE中簡(jiǎn)單的緩沖溶液，從而引起電泳行為和分離機(jī)理上的差別。目前MECC已成功地用于生物醫(yī)藥分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)及化工產(chǎn)品與食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域。特別是MECC采用手性分配相，可用于手性化合物的分離，這一方法比氣相色譜（GC）和高效液相色譜（HPLC，采用手性固定相更為方便、實(shí)用具有很好的應(yīng)用前景。毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）是80年代后期發(fā)展起來(lái)的毛細(xì)管電泳的主要分離模式之一。它將凝膠電泳對(duì)生物大分子的高效分離能力和毛細(xì)管電泳的快速、微量和定量分析相結(jié)合。成為當(dāng)今分離度極高的一種電泳分離技術(shù)。在CZE中，荷電粒子的分離主要是基于它的荷質(zhì)比不同，而在CGE中，溶質(zhì)的分離依賴于溶質(zhì)的凈電荷性質(zhì)和分子大小兩個(gè)因素。凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)溶質(zhì)具有分子篩作用，當(dāng)帶電溶質(zhì)通過(guò)聚合物網(wǎng)絡(luò)時(shí)，產(chǎn)生了阻礙，溶質(zhì)分子越大，阻礙越大。尤其是對(duì)那些荷質(zhì)比不隨分子大小而變的大分子如DNA或SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物,沒有凝膠的篩分作用就不能分離。下圖為帶電生物大分子在CGE中的分離過(guò)程。CGE在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)上有著十分廣泛的應(yīng)用。在分子生物學(xué)上實(shí)現(xiàn)了包括寡聚核苷酸純化、反應(yīng)基因療法、DNA測(cè)序和PCR產(chǎn)物的分析，在蛋白質(zhì)化學(xué)方面用于多肽和蛋白質(zhì)分子的分子量測(cè)定，原蛋白和SDS結(jié)合蛋白的分離等。另外，CGE還可用于其他帶電物質(zhì)的分離,并可通過(guò)加入添加劑如手性添加劑、離子對(duì)試劑、絡(luò)合試劑等改變分離的選擇性。毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）是指在毛細(xì)管中進(jìn)行的等電聚焦，由于毛細(xì)管本身的抗對(duì)流性質(zhì)，CIEF可在自由溶液中進(jìn)行，也可在凝膠中進(jìn)行oCIEF不但具有傳統(tǒng)等電聚焦的優(yōu)點(diǎn)而且也同時(shí)具有毛細(xì)管電泳的高效、快速、微量和往上檢測(cè)等特點(diǎn)，使CIEF在蛋白質(zhì)、多肽的分離分析上有很好的應(yīng)用前景。CIEF是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pl）不同而進(jìn)行分離的。采用兩性電解質(zhì)混合物作為載體電解質(zhì)，當(dāng)在用溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)混合溶液充滿的毛細(xì)管兩端加電場(chǎng)時(shí)，pI值大于兩性電解質(zhì)混合物pH值的溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)帶正電，向負(fù)極移動(dòng)；pI值小于兩性電解質(zhì)混合物pH值的溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)帶負(fù)電，向正極移動(dòng)，當(dāng)它們遷移至pH=pI值區(qū)帶時(shí)，凈電荷為零，不再遷移。因此不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中從陽(yáng)極到陰極按pl值逐漸增加連續(xù)排列，從而形成穩(wěn)定的pH梯度，梯度中每一處的pH，將取決于該處兩性電解質(zhì)的pl值。同樣，蛋白質(zhì)由于其等電點(diǎn)的不同而得到分離。這個(gè)過(guò)程稱為等電聚焦°CIEF整個(gè)分離過(guò)程如下圖所示。等電聚焦過(guò)程的狀態(tài)可以用電流來(lái)指示，一旦聚焦完成達(dá)到穩(wěn)態(tài)，電荷不再移動(dòng)，即電流為零。在聚焦完成后，溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)被移動(dòng)，區(qū)帶通過(guò)檢測(cè)窗。這種移動(dòng)可以通過(guò)從毛細(xì)管一端施加壓力或在一個(gè)電極槽中加入鹽類來(lái)實(shí)現(xiàn)。毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳（CITP）是一種“移動(dòng)界面”電泳技術(shù)。在CITP中，使用兩個(gè)緩沖液系統(tǒng)，建立一個(gè)所有區(qū)帶以相同速度移動(dòng)的狀態(tài)。兩個(gè)緩沖液分別稱為前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，樣品加在前導(dǎo)和尾隨電解質(zhì)交界處。一次CITP實(shí)驗(yàn)只能分離正離子或負(fù)離子，不能同時(shí)分析。CITP的分離過(guò)程見下圖所示。在CITP中，各種離子（正或負(fù)離子）以獨(dú)立的區(qū)帶移動(dòng)，但移動(dòng)速度相等，等于前導(dǎo)離子的移動(dòng)速度。如果任何兩個(gè)相鄰區(qū)帶中正或負(fù)離子移動(dòng)速度不一樣，則必然導(dǎo)致區(qū)帶之間脫開，使脫開區(qū)缺少正離子或負(fù)離子，這是電中性原理不容許的。在分離過(guò)程中場(chǎng)強(qiáng)會(huì)自行調(diào)整以維持區(qū)帶的等速移動(dòng)（遷移速率二淌度X場(chǎng)強(qiáng)），淌度大的離子所在的區(qū)帶場(chǎng)強(qiáng)較低，這種現(xiàn)象使各個(gè)區(qū)帶間保持著明顯的界面。如果一個(gè)離子擴(kuò)散到另一個(gè)相鄰的區(qū)帶，它的遷移速率發(fā)生變化，使其很快又回到原來(lái)所在的區(qū)帶。CITP另一個(gè)有趣特征是在每一個(gè)區(qū)帶內(nèi)，溶質(zhì)的濃度