天然產(chǎn)物化學(xué)02-2-分離和鑒定

第二節(jié)分離精制和鑒定的方法與技術(shù)1化學(xué)成分分離精制常用方法原理1、根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離

2、根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離3、根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離4、根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離5、根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離23利用溫度不同引起溶解度的改變結(jié)晶、重結(jié)晶待純化物A+雜質(zhì)B、C加MeOH熱溶熱濾殘渣（C）濾液（A+B）冷置析晶母液（B）結(jié)晶（A）5加另一種極性相差較大的溶劑——混合溶劑極性改變——部分物質(zhì)沉淀析出

A．水/醇法：除去水提液中的水溶性雜質(zhì)

B．醇/水法：除去醇提液中的脂溶性雜質(zhì)

C．醇/醚法（醇/丙酮法）：純化皂苷改變混合溶劑極性6A．水/醇法——除去水提液中的水溶性雜質(zhì)中藥水提取液加數(shù)倍量濃醇靜置過夜母液（目標(biāo)成分）沉淀（水溶性雜質(zhì)）（如蛋白質(zhì)、多糖、果膠、粘液質(zhì)）7B．醇/水法：除去醇提液中的脂溶性雜質(zhì)中藥醇提取液加數(shù)倍水靜置過夜母液（目標(biāo)成分）沉淀（脂溶性雜質(zhì)）（如油脂、葉綠素等）8C．醇/醚法（醇/丙酮法）：純化皂苷皂苷的醇溶液加數(shù)倍量乙醚，靜置母液（脂溶液雜質(zhì)）沉淀（皂苷）9酸、堿、兩性成分調(diào)節(jié)PH——改變的分子存在狀態(tài)——改變?nèi)芙舛日{(diào)節(jié)pH解離型/離子態(tài)游離型/分子態(tài)H+BH+BOH-H+A-HAOH-脂溶性水溶性10A．酸/堿法（酸提取堿沉淀法）：生物堿的提取、純化B．堿/酸法（堿提取酸沉淀法）：黃酮、蒽醌等酚性成分的提取、純化C.調(diào)節(jié)PH至等電點(diǎn)，沉淀蛋白11A．酸/堿法（酸提取堿沉淀法）

——生物堿的提取、純化H+BH+BOH-醇提物浸膏（B）藥渣酸水提取液稀酸水提?。˙H+

）堿化沉淀（B）堿水液（水溶性雜質(zhì)）（脂溶性雜質(zhì)）12藥材（HA）藥渣堿水提取液堿水提?。ˋ-

）酸化沉淀（HA）酸水液（水溶性雜質(zhì)）（脂溶性雜質(zhì)）B．堿/酸法（堿提取酸沉淀法）

——黃酮、蒽醌等酚性成分的提取、純化H+A-HAOH-13沉淀法在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。

（1）鉛鹽沉淀法

（2）試劑沉淀法14⑴鉛鹽沉淀法鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。醋酸鉛及堿式醋酸鉛，能與多種化學(xué)成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。中性醋酸鉛可與酸性物質(zhì)或某些酚性物質(zhì)結(jié)合成不溶性鉛鹽。因此，常用以沉淀有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等。與堿式醋酸鉛產(chǎn)生不溶性鉛鹽或絡(luò)合物的范圍更廣。15⑵試劑沉淀法在生物堿鹽的溶液中，加入某些生物堿沉淀試劑，則生物堿生成不溶性復(fù)鹽而析出。水溶性生物堿難以用萃取法提取分出，常加入雷氏銨鹽使生成生物堿雷氏鹽沉淀析出用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì)；膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等。16172、根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離分配系數(shù)（K）兩種相互不能任意混溶的溶劑（如氯仿與水）如置分液漏斗中充分振搖，放置后即可分成兩相。此時如果其中含有溶質(zhì)，則溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配比（K）在一定溫度及壓力下為一常數(shù)，可以下式表示：K=CU/CLK：分配系數(shù)；CU：溶質(zhì)在上相溶劑中的濃度；CL：溶質(zhì)在下相溶劑中的濃度。18①液-液萃取法②逆流連續(xù)萃取法③逆流分配法（CCD）

④液滴逆流色譜法（DCCC）⑤高速逆流色譜法（HSCCC）⑥氣液分配色譜（GC或GLC）⑦液-液分配色譜（LC或LLC）19液-液萃取法利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法。萃取時如果各成分的分配系數(shù)相差越大，分離效率越高。20系統(tǒng)溶劑萃取法：

常用來粗分，是將總提物分散于水中，依次用石油醚（或環(huán)己烷）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓回收溶劑得到相應(yīng)極性的成分。21水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機(jī)溶劑，如苯、氯仿或乙醚進(jìn)行兩相萃取；有效成分是偏于親水性的物質(zhì)，需用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、正丁醇等。提取黃酮類成分多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強(qiáng)的皂甙則多選用正丁醇、異戊醇和水作兩相萃取。22極性成分類型適宜溶劑強(qiáng)親脂性揮發(fā)油、脂肪油、苷元石油醚脂溶性色素、甾醇己烷親脂性苷元、生物堿、樹脂乙醚醛、醇、酯、有機(jī)酸氯仿小強(qiáng)心苷氯仿-乙醇（2：1）中極性中黃酮苷乙酸乙酯大皂苷、蒽醌苷正丁醇親水性極性很大的苷、糖類丙酮

氨基酸、某些生物堿鹽甲醇、乙醇強(qiáng)親水性蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、氨基酸水果膠、糖類、、無機(jī)鹽類23逆流連續(xù)萃取法

利用兩相溶劑比重不同可自然分層和分散液滴穿過連續(xù)相溶劑時發(fā)生傳質(zhì)的原理，用一根或數(shù)根萃取管制成逆流連續(xù)萃取裝置。管內(nèi)的瓷環(huán)，增加液滴上升的路程和在連續(xù)相中停留的時間，更重要的是上升的液滴因撞擊填充物而被分散，擴(kuò)大了兩相溶劑萃取的接觸面積，使更萃取完全?？朔朔忠郝┒范啻屋腿『鸵兹榛穆闊?。24一、簡述

氣液分配色譜以惰性氣體為流動相、以固定液作為固定相的色譜法稱為氣相色譜法（GC）。氣液色譜的固定相是在化學(xué)惰性的固體顆粒表面上，涂一層高沸點(diǎn)有機(jī)化合物的液膜或直接將高沸點(diǎn)有機(jī)化合物均勻地涂敷在毛細(xì)管的內(nèi)壁，并形成一層均勻的液膜。25在氣液色譜中，當(dāng)載氣攜帶被測樣品進(jìn)入色譜柱，氣相中的被測組分就溶解到固定液中。載氣連續(xù)流經(jīng)色譜柱，溶解在固定液中的組分會從固定液中揮發(fā)到氣相中，隨著載氣的流動，揮發(fā)到氣相中的組分又會重新溶解到前面的固定液中。這樣反復(fù)多次溶解、揮發(fā)、再溶解、再揮發(fā)。由于各組分在固定液中的溶解度不同，溶解度大的組分較難揮發(fā)停留在色譜柱中的時間就長些；而溶解度小的組分易揮發(fā)，停留在色譜柱中的時間就短些，經(jīng)過一定時間后，各組分就彼此分離并依次流出色譜柱。26氣相色譜法的優(yōu)點(diǎn)分離效率高：是指它對性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力。靈敏度高：使用高靈敏度的檢測器可檢測出痕量組分。分析速度快：相對化學(xué)分析而言，完成多組分分析僅需幾分鐘至幾十分鐘。分析需要樣品量很少。27高效液相色譜（HPLC）HPLC是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上引入氣相色譜的塔板理論，并采用了高壓輸液泵、高效固定相和高靈敏度的檢測器，具有分析速度快、分離效率高和操作自動化特點(diǎn)的一種色譜技術(shù)。28HPLC特別適合高沸點(diǎn)、大分子和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析。中藥的成分非常復(fù)雜，以往常用的薄層色譜等方法因其精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、重現(xiàn)性差而不能滿足中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需要。高效液相色譜正是以其穩(wěn)定、可靠、高效的特點(diǎn)成為中藥研究的最重要的分析方法。常用于中藥質(zhì)量的控制、天然藥物化學(xué)成分的分離及分析測定等。293031323334硅膠和氧化鋁為極性吸附劑，有以下特點(diǎn)：①對極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力。故同為溶質(zhì)，極性強(qiáng)者將被優(yōu)先吸附。②溶劑極性越弱，則吸附劑對溶質(zhì)將表現(xiàn)出越強(qiáng)的吸附能力。溶劑極性增強(qiáng)，則吸附劑對溶質(zhì)的吸附能力即隨之減弱。③溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強(qiáng)的溶劑時，又可被后者置換洗脫下來。

35活性炭因為是非極性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反，對非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力，在水中對該類物質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)的吸附能力。溶劑極性降低，則活性炭對該類物質(zhì)的吸附能力也隨之降低。故從活性炭上洗脫被吸附物質(zhì)時，洗脫溶劑的洗脫能力將隨溶劑極性的減弱而增強(qiáng)。363738被分離物質(zhì)的性質(zhì)被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附性強(qiáng)。394041吸附簿層色譜薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進(jìn)行層析時，即稱薄層層析。42

薄層層析法應(yīng)用①化學(xué)成分的預(yù)試②化學(xué)成分的鑒定③探索柱層分離的條件4344制備薄層色譜（PTLC）一種是流動相靠毛細(xì)管作用力流經(jīng)固定相（傳統(tǒng)的制備型薄層色譜），另一些方法是流動相靠外力強(qiáng)制流動，如離心薄層色譜和加壓薄層色譜。45制備薄層色譜（PTLC）吸附劑

硅膠是最常用的吸附劑。上樣量與吸附劑的厚度有關(guān)。

上樣

上樣前先用樣品溶于少量溶劑，樣品濃度應(yīng)在5%-10%左右。展開劑的選擇及展開

在進(jìn)行PTLC之前應(yīng)用分析型TLC預(yù)試驗來確定展開劑。被分離物質(zhì)的回收

46吸附柱色譜（柱層析）47（1）吸附劑的用量

一般為樣品量的30～60倍。柱色譜用的硅膠及氧化鋁通常以100～200目或200～300目為宜，或甚至直接采用薄層色譜用規(guī)格，其分離效果可以大大提高。（2）洗脫劑的選擇，以TLC摸索洗脫條件裝柱，濕法裝柱（以起始洗脫劑拌勻裝柱）或干法裝柱48（3）樣品的預(yù)處理能直接溶于洗脫劑的樣品用適量洗脫劑溶解樣品，盡可能少，以利樣品在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。不能溶解于洗脫劑的樣品，則將用能使之溶解的溶劑溶解后，再用少量吸附劑拌勻，并減壓抽干溶劑或在60℃下加熱揮盡溶劑，置真空干燥器中減壓干燥或直接減壓抽干、研粉后再小心鋪在吸附劑柱上。49（4）洗脫用溶劑的極性宜逐步增加，跳躍不能太大。實踐中多用混合溶劑，并通過巧妙調(diào)節(jié)比例以改變極性，達(dá)到梯度洗脫分離物質(zhì)的目的。一般混合溶劑中強(qiáng)極性溶劑的影響比較突出，故不可隨意將極性差別很大的兩種溶劑組合在一起使用。5051（5）為避免發(fā)生化學(xué)吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠、堿性物質(zhì)則宜用氧化鋁進(jìn)行分離。硅膠、氧化鋁用適當(dāng)方法處理成中性時，情況會有所緩解。通常在分離酸性（或堿性）物質(zhì)時，洗脫溶劑中分別加入適量醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），?？墒盏椒乐雇衔?、促進(jìn)分離的效果。5253545556聚酰胺色譜的應(yīng)用聚酰胺對一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的（鞣質(zhì)除外），分離效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色譜特別適合于該類化合物的制備分離。對生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離也有廣泛的用途。因為對鞣質(zhì)的吸附特強(qiáng)，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脫鞣質(zhì)處理特別適宜。聚酰胺色譜也有薄層色譜和柱色譜兩種方式。

575859大孔吸附樹脂分離條件的確立樹脂的選擇首先，要根據(jù)被分離化合物的分子體積的大小通過預(yù)實驗確定適當(dāng)孔徑的樹脂。其次，要根據(jù)分子中是否含有酚羥基、羧基或堿性氮原子來確定樹脂的型號和分離條件。6061影響分離的因素：

分子極性的大?。簶O性較大的化合物適宜于在中極性的樹脂上分離，而極性較小的化合物則適于在非極性樹脂上分離。對于中極性樹脂來說，被分離化合物分子上能形成氫鍵的基團(tuán)越多，吸附力越強(qiáng)。

62

分子體積的影響：對于非極性大孔吸附樹脂而言，化合物體積越大，吸附力越強(qiáng)，這與大體積分子疏水性強(qiáng)有關(guān)。

63pH：

一般酸性化合物在適當(dāng)酸性溶液中可被充分吸附，堿性化合物則在堿性條件下易被吸附，中性化合物在中性情況下吸附較好。64大孔吸附樹脂的處理市售大孔吸附樹脂一般含有未聚合的單體、致孔劑（多為長碳鏈的脂肪醇類）、分散劑和防腐劑等雜質(zhì)，使用前必須經(jīng)過處理。處理方法是：采用乙醇濕法裝柱，隨用乙醇在柱上作流動清洗，并不時檢查流出的乙醇，直至流出的乙醇液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后用大量蒸餾水洗去乙醇。65大孔吸附樹脂柱色譜樣品一般用水溶液上柱。洗脫時根據(jù)吸附作用強(qiáng)弱不同選用不同濃度的甲醇、乙醇等含水溶劑，直至純的甲醇、乙醇，乃至丙酮、乙酸乙酯等。對非極性大孔吸附樹脂，洗脫溶劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。對于中等極性的大孔吸附樹脂和極性較大的化合物來說，則以用極性較大的溶劑為宜。66樹脂柱的清冼和再生：用乙醇、丙酮、異丙醇、2-5%鹽酸、2-5%氫氧化鈉滲漉法洗脫或回流。洗脫順序：一般被分離物質(zhì)極性越小，越先被洗脫下來，極性越大，越后洗脫下來。67大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中的應(yīng)用（1）活性成分的提取分離

如皂甙（人參總皂甙、蒺藜總皂昔）、黃酮（葛根總黃酮、山楂總黃酮、淫羊藿總黃酮）、內(nèi)酯、生物堿等化合物；（2）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定

除去干擾成分。

68大孔吸附樹脂

在中藥生產(chǎn)中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)縮小劑量，提高制劑的內(nèi)在質(zhì)量減小產(chǎn)品的吸濕性有效去除重金屬6970717273凝膠過濾法分離原理葡聚糖凝膠在水中膨脹成球形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內(nèi)部（即被排阻在凝膠粒子外部），故在顆粒間隙移動，并隨溶劑一起從柱底先行流出；小分子因可自由滲入并擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)部，故通過色譜柱阻阻力增大、流速邊緩，將較晚流出。樣品混合物中各個成分因分子大小各異，滲入至凝膠顆粒內(nèi)部的程度也不盡相同，故在經(jīng)歷一段時間流動并達(dá)到動態(tài)平衡后，即按分子由大到小順序先后流出并得到分離。7475①葡聚糖凝膠由平均分子量一定的葡聚糖及交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成。凝膠顆粒網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)劑的用量及反應(yīng)條件。交聯(lián)劑用量越多，即交聯(lián)度越高，則網(wǎng)孔越緊密，孔徑越小，吸水膨脹越??；交聯(lián)度越低，則網(wǎng)孔越稀疏，孔徑越大，吸水膨脹也越大。商品型號即按交聯(lián)度大小分類，并以吸水量多少表示。以SephadexG-25為例，G為凝膠（Gel），后附數(shù)字=吸水量×10，故G-25示該葡聚糖凝膠吸水量為2.5ml/g。SephadexG型只適用于在水中應(yīng)用，不同規(guī)格適合不同分子量的物質(zhì)。76②羥丙基葡聚糖凝膠為SephadexG經(jīng)羥丙基化處理后得到的產(chǎn)物。其分子中的葡萄糖部分與羥丙基以醚鍵形式結(jié)合。與SephadexG比較，SephadexHL-20分子中-OH基總數(shù)雖無改變，但碳原子所占比例卻相對增加。因此與SephadexG僅具親水性不同，不僅可在水中應(yīng)用，也可在極性有機(jī)溶劑或它們與水組成的混合溶劑中膨潤使用。SephadexLH-20除保留有SephadexG-25原有的分子篩特性，可按分子量大小分離物質(zhì)外，在由極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中常常起到反相分配色譜的效果，適用于不同類型有機(jī)化合物的分離。77超濾法超濾法是現(xiàn)代分離技術(shù)領(lǐng)域中先進(jìn)的技術(shù)之一。可以在原生物體系環(huán)境下實現(xiàn)物質(zhì)分離，高效濃縮富積產(chǎn)物，有效去除雜質(zhì)。78超濾法分離的原理超濾是一種以壓力為驅(qū)動力，利用超濾膜的篩分作用，根據(jù)相對分子質(zhì)量的不同來進(jìn)行分離的膜技術(shù)。超濾膜的孔徑通常在1~300nm之間，選用不同孔徑的超濾膜，可以將相對分子質(zhì)量在幾百到幾十萬之間的物質(zhì)進(jìn)行分離。待分離組分的大小一般要相差10倍以上。79超濾膜的選擇1、膜孔徑（截留分子量）的選擇

膜的孔徑或截留分子量的選擇雖然主要是根據(jù)被分離物的相對分子質(zhì)量。由于超濾膜具有一定的孔徑分布，加之中藥提取液的粘度較大，所含高分子膠體物質(zhì)較多，膜污染現(xiàn)象較嚴(yán)重。因此，膜的孔徑或截留分子量應(yīng)稍大一些。802、膜材質(zhì)的選擇

膜表面是液體和膜相互作用的界面，溶質(zhì)和膜之間有靜電相互作用或電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)，膜表面的極性、溶液的pH值等均會影響膜的分離效率。中藥成分中膠質(zhì)等粘性物質(zhì)的含量很高，膜的污染現(xiàn)象較為嚴(yán)重。因此，最好采用抗污性較好的膜材料，如聚丙烯腈、磺化聚砜膜等。81超濾法的特點(diǎn)選擇性高，分離效率高減少工序，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約原料，降低成本物質(zhì)不發(fā)生相變，常溫操作去雜質(zhì)效果好除熱原效果好除菌效果好82超濾膜分離技術(shù)應(yīng)用膜分離做為一種高效、節(jié)能、無污染的新型分離技術(shù)，在日本已應(yīng)用到“漢方藥”的生產(chǎn)中；國內(nèi)同仁堂的藥酒生產(chǎn)也采用了該技術(shù)。此外，還用于某些中藥注射劑的研究開發(fā)和生產(chǎn)。超濾膜分離技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用曾被列為國家“八五”重點(diǎn)科技項目。83中藥有效部位和有效成分的分離純化②濃縮，提高藥效成分濃度，減少劑量③制備中藥注射劑、制備中藥口服液等④有機(jī)溶劑回收84透析法透析法是膜過濾法中的一種。

原理：利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜、而大分子物質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，以達(dá)到分離的目的，本質(zhì)上是一種分子篩作用。

85

應(yīng)用：對于生物大分子，一般可以通過透析法進(jìn)行濃縮和精制（如藥用酶的精制）。

分離和純化皂苷、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子物質(zhì)，可將其留在半透膜內(nèi)，而將如無機(jī)鹽、單糖、雙糖等小分子的物質(zhì)透過半透膜，進(jìn)入膜外的溶液中，而加以分離精制。865、根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離

離子交換法

離子交換樹脂為固定相，用水或含水溶劑裝柱含水流動相通過樹脂可交換離子與樹脂上的交換基團(tuán)交換，吸附到樹脂上中性及無交換離子的成分流出將吸附到柱上的成分洗脫下來87離子交換樹脂的種類陽離子交換樹脂：強(qiáng)酸性（-SO3-H+）弱酸性（-COO-H+）陰離子交換樹脂：強(qiáng)堿性（-N+（CH3）3Cl-）弱堿性（-NH2，-NH-，-N=）88離子交換樹脂的應(yīng)用不同電荷離子的分離如水提液中酸性、堿性、兩性化合物的分離相同電荷但解離程度不同離子的分離

如堿性不同的生物堿的分離

89水提液中酸性、堿性、兩性化合物的分離90

ⅠⅡ堿性Ⅰ＜Ⅱ＜

Ⅲ

Ⅲ

ⅡⅠ堿性不同的生物堿的分離919293未知化合物結(jié)構(gòu)鑒定流程1、初步推斷化合物類型：測定物理常數(shù)，進(jìn)行鑒別反應(yīng)，文獻(xiàn)調(diào)研2、測定分子式：元素分析，分子量測定3、結(jié)構(gòu)分析：確定分子式中含有的官能團(tuán)，或結(jié)構(gòu)片段，或基本骨架（UV、IR、NMR、MS）944、結(jié)構(gòu)驗證：