朱明華版第三章液相色譜分析

*第三章高效液相色譜分析法HighPerformanceLiquidChromatograph第一節(jié)概述及液相色譜儀器第二節(jié)主要分離類型與原理第三節(jié)液相色譜的固定相與流動(dòng)相第四節(jié)影響分離的因素與操作條件的選擇第一節(jié)概述及液相色譜儀器第三章高效液相色譜分析法*一、高效液相色譜的發(fā)展在所有色譜技術(shù)中，液相色譜法是最早（1903年）發(fā)明的，但其初期發(fā)展比較慢。20世紀(jì)60年代后期，將已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)應(yīng)用到液相色譜上來，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。液相色譜儀于1969年商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色譜就被稱為高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）。*氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC則只需要樣品能夠制成溶液，大多數(shù)情況下不需要加熱，所以對樣品的揮發(fā)性沒有要求。因此對于那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)（約占有機(jī)物質(zhì)的75％～80％）也能夠分析?，F(xiàn)在，HPLC的應(yīng)用范圍已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過氣相色譜，位居色譜法之首。一、高效液相色譜的發(fā)展*高壓、高效、高速、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)物及生化試樣的高效分離分析方法。二、高效液相色譜法的特點(diǎn)*三、高效液相色譜儀器（Waters）

*三、高效液相色譜儀器（安捷倫）

*三、高效液相色譜儀器（島津）

*1.流程四、流程及主要部件*(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。2.主要部件*應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性可分為恒流泵和恒壓泵兩大類。恒流泵包括氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類機(jī)械泵：螺旋傳動(dòng)注射泵、單活塞往復(fù)柱塞泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵

(1)高壓輸液泵*單活塞往復(fù)柱塞泵**氣動(dòng)放大泵*流動(dòng)相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進(jìn)入檢測器后會(huì)在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會(huì)變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進(jìn)入色譜柱,排出這些氣泡則很費(fèi)時(shí)間。在熒光檢測中,溶解氧還會(huì)使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。

（2）脫氣裝置*

目前，液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。超聲波振蕩脫氣：將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10-20min。惰性氣體鼓泡吹掃脫氣：將氣源（鋼瓶）中的氣體（氦氣）緩慢而均勻地通入儲(chǔ)液罐中的流動(dòng)相中，氦氣分子將其它氣體分子置換和頂替出去，而它本身在溶劑中的溶解度又很小，微量氦氣所形成的小氣泡對檢測無影響。

（2）脫氣裝置*真空脫氣裝置：將流動(dòng)相通過一段由多孔性合成樹脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時(shí)，膜外側(cè)被減壓，分子量小的氧氣、氮?dú)?、二氧化碳就?huì)從膜內(nèi)進(jìn)入膜外而被脫除。一般的真空脫氣裝置有多條流路，可同時(shí)對多個(gè)溶液進(jìn)行脫氣。（2）脫氣裝置*在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。（3）梯度淋洗裝置*梯度洗脫操作低壓梯度：

只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。高壓梯度：

一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。**流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：（4）進(jìn)樣裝置*

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。（5）高效分離柱*

a.紫外檢測器，應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍寬；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；

對流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

（6）液相色譜檢測器*b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展；1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。**光電二極管陣列檢測器除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；

靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫。

c.示差折光檢測器*

高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；d.熒光檢測器ELSD是基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測器。由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。e.蒸發(fā)光散射檢測器*第三章高效液相色譜分析法第二節(jié)主要分離類型與原理*一、液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。基本原理：組分在固定相吸附劑上有吸附作用，且吸附力有差異，經(jīng)過多次吸附與解吸而被分離；適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；*機(jī)制：溶質(zhì)分子(X)和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：式中：Xm--流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質(zhì)分子；Sm--流動(dòng)相中的溶劑分子。當(dāng)吸附競爭反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)：式中：K為吸附平衡常數(shù)，亦即分配系數(shù)。一、液-固吸附色譜二、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度不同；

a.正相液—液分配色譜法:流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。b.反相液—液分配色譜法:流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。*c.液—液分配色譜法的缺點(diǎn)：固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相，可克服上述缺點(diǎn)?；瘜W(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。二、液-液分配色譜三、離子對色譜原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；其原理可用下式表示：

X+水相+Y-水相===X+Y-有機(jī)相式中：X+水相——流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子）；Y-水相——流動(dòng)相中帶相反電荷的對離子；X+Y-——形成的粒子對化合物。當(dāng)達(dá)平衡時(shí)：KXY=[X+Y-]有機(jī)相/[X+]水相[Y-]水相分配系數(shù)為：DX=[X+Y-]有機(jī)相/[X+]水相=KXY[Y-]水相離子對色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。*陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對Y+

X-后；在兩相間分配。三、離子對色譜*四、離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-*分離原理：由于靜電場相互作用，樣品陰離子以及淋洗劑陰離子（也稱淋洗離子）都與固定相中帶正電荷的交換基團(tuán)作用，樣品離子不斷地進(jìn)入固定相，又不斷地被淋洗離子交換而進(jìn)入流動(dòng)相，在兩相中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。四、離子交換色譜*以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：X-(溶劑中)+(樹脂-R4N+Cl-)=(樹脂-R4N+X-)+Cl-(溶劑中)當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)：KX=[樹脂-R4N+X-][Cl-]/[樹脂-R4N+Cl-][X-]分配系數(shù)為：DX=[樹脂-R4N+X-]/[X-]=KX[樹脂-R4N+Cl-]/[Cl-]組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長；于是不同的離子相互分離。四、離子交換色譜五、離子色譜

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。五、離子色譜抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型

分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01～0.05毫摩爾/克干樹脂。*非抑制型:

當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.007～0.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。吸附反應(yīng)：R-OH-

+Na+Br-

＝R-Br-+Na+OH-洗脫反應(yīng)：R-Br-

+Na+OH-＝R-OH-+Na+Br-

抑制反應(yīng)：R-H++Na+OH-

＝R-Na++H2OR-H++Na+Br-

＝R-Na++H+Br-

五、離子色譜*六、排阻色譜固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子在最后出峰。可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離*第三節(jié)液相色譜的固定相與流動(dòng)相一、固定相二、流動(dòng)相*一、液相色譜固定相

1.液-液分配及離子對色譜法固定相早期的液－液分配色譜固定相都是在一定擔(dān)體（全多孔型擔(dān)和體表面多孔型擔(dān)體）上涂上固定液制得，種類比較少，也容易產(chǎn)生柱流失，現(xiàn)在已很少使用。

*

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N（2）化學(xué)鍵合固定相*（2）化學(xué)鍵合固定相

存在著雙重分離機(jī)制：高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；*化學(xué)鍵合固定相具有如下一些特點(diǎn)：

表面沒有坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多；

無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命；

可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分析；

有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。

（2）化學(xué)鍵合固定相**極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。非極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱就是最典型的代表，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。

（2）化學(xué)鍵合固定相*正相HPLC（normalphaseHPLC）：

是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動(dòng)相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC，早期的液相色譜中曾廣泛采用這種體系。對于一些在非極性疏水固定相中強(qiáng)烈保留的有機(jī)分子常常采用正相HPLC模式。（2）化學(xué)鍵合固定相*極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。非極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱就是最典型的代表，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。

（2）化學(xué)鍵合固定相*2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型（應(yīng)用最廣）和薄殼型；粒度：5～10μm；

石墨柱：Thermo，hypercarb石墨柱：Thermo，hypercarb*3.離子交換色譜分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄膜型離子交換樹脂

（2）離子交換鍵合固定相

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）*4.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；

水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；

非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；

化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。*二、液相色譜的流動(dòng)相

選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意下列幾個(gè)因素：(1)流動(dòng)相純度：防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。(2)避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子：如在液-液色譜中，流動(dòng)相應(yīng)與固定液互不相容，否則，會(huì)使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。(3)對試樣要有適宜的溶解度：試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。(4)溶劑的粘度小些為好：否則，會(huì)降低試樣組分的擴(kuò)散系數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。(5)應(yīng)與檢測器相匹配：例如，當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。

*

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。例如，采用相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油

有時(shí)還需要選用多元溶劑，以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。選擇時(shí)要參閱有關(guān)手冊，并通過實(shí)驗(yàn)確定。二、液相色譜的流動(dòng)相*2.1、分配色譜中的流動(dòng)相選擇規(guī)律正相色譜中，以低極性溶劑如正己烷、苯、氯仿為底劑；反相色譜中，以不同比例混合而成的甲醇/水、乙腈/水沖洗體系是最常見的，二元溶劑系統(tǒng)，在甲醇/水、乙腈/水體系中加入適量的四氫呋喃組成三元溶劑系統(tǒng)可以進(jìn)一步提高沖洗強(qiáng)度，三種溶劑所具有的洗脫能力幾乎可以解決所有樣品的洗脫問題.*2.2、離子交換色譜在水介質(zhì)中進(jìn)行，組分的保留值用流動(dòng)相中鹽的濃度和PH值控制。流動(dòng)相離子類型對組分的保留能力有較大影響。*2.3、排阻色譜溶劑要與凝膠本身相似，對于軟質(zhì)凝膠，溶劑必須能溶脹凝膠。常用溶劑有：氯仿、甲醇、水、緩沖鹽溶液、四氫呋喃、間苯三酚等。*第四節(jié)影響分離的因素與操作條件的選擇factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition第三章高效液相色譜分析法HighPerformanceLiquidChromatograph*一、影響分離的因素1.影響分離的因素與提高柱效的途徑在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即：

H=A+Cu故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。20.5*

液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。

由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫

改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。一、影響分離的因素2023/2/4

要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。1、相對分子質(zhì)量對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。二、分離類型選擇2023/2/42.溶解度水溶