耿婷婷-基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立(西北大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)PPT)

基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立答辯人：耿婷婷導(dǎo)師：陳超崔亞麗GoldMag-AS微米金磁微粒磁內(nèi)核金外殼金殼層：納米級金顆粒生物分子固定化容量大

非共價(jià)偶聯(lián)：Au-S相互作用

疏水

靜電

磁核心:超順磁性，易于分離

一背景介紹國家衛(wèi)生部傳染病法定報(bào)告：2005年全國發(fā)病人數(shù)第五位2007年全國發(fā)病人數(shù)第三位

年份全國梅毒報(bào)告病例首例梅毒病例在1979年重慶市報(bào)告梅毒螺旋體梅毒在我國已成為一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題，輸血必檢項(xiàng)目之一?？焖傺獫{反應(yīng)素試驗(yàn);假陰假陽梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(yàn);方便、靈敏度低梅毒螺旋體特異性抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn);靈敏度中等梅毒螺旋體核酸檢測法；靈敏度高、昂貴梅毒螺旋體特異性抗體化學(xué)發(fā)光法檢測;靈敏度高金磁微粒為載體的化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測系統(tǒng)金磁：比表面積大；可自動(dòng)化操作?；瘜W(xué)發(fā)光：靈敏度高。二.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.建立磁酶免化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測TP抗體2.血液中TP篩查，提高輸血安全性3.血站自動(dòng)化病原篩查三.實(shí)驗(yàn)原理＋HRP化學(xué)發(fā)光Luminol,H2O2,PIPTMB底物檢測吸光度與樣品濃度成正比｛＋HRPAg-Ab-酶復(fù)合物四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析TP抗原免疫磁珠的制備1磁酶免反應(yīng)條件的優(yōu)化2化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化3磁酶免化學(xué)發(fā)光法建立及方法價(jià)4（一）TP抗原免疫磁珠的制備磁粒與抗體偶聯(lián)封閉，清洗，磁性分離，棄上清保存磁粒中加入抗體（一）TP抗原免疫磁珠的制備1.TP抗原在金磁微粒表面的固定化TP抗原包被前后的紫外吸收曲線一步偶聯(lián)：磁粒表面靜電作用；疏水相互作用；半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基與金的作用等。（一）TP抗原免疫磁珠的制備2.優(yōu)化免疫磁珠的包被時(shí)間1min、5min、10min、15min、20min、30min、60min20min左右即可完成偶聯(lián)反應(yīng)選取30min為最佳包被時(shí)間（一）TP抗原免疫磁珠的制備3.選擇磁粒的濃度：10μg/孔、30μg/孔、50μg/孔、100μg/孔

過低：陽性值低過高：磁粒不透光影響發(fā)光信號選擇：30μg/孔磁粒濃度（

μg/孔）化學(xué)發(fā)光信號（一）TP抗原免疫磁珠的制備4.優(yōu)化封閉反應(yīng)條件：陽性陰性陽性／陰性4℃過夜1.9061.8840.0800.07324.7737℃2h+4℃過夜1.7451.8150.0300.01972.65常用封閉條件為4C過夜，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)4C過夜并不適用于金磁微粒的封閉，達(dá)不到理想的封閉效果，陰性值較高。磁性微粒4C過夜時(shí)基本完全沉降在管底，不能充分反應(yīng)導(dǎo)致。

增加37C震蕩2h，明顯加強(qiáng)了封閉效果，陰性值較低。（一）TP抗原免疫磁珠的制備5.選擇合適封閉劑1％明膠、10％小牛血清、0.5%BSA、5%奶粉、10%奶粉、

5％奶粉＋2％小牛血清

陽性陰性陽性／陰性1%明膠——————————10%小牛血清1.7651.7230.4960.4353.750.5％BSA2.2992.160.2530.3137.885%奶粉2.2272.3090.1780.14214.1810%奶粉——————————5％奶+2％小牛血清1.7451.8150.030.01972.65（二）TP抗體的免疫學(xué)結(jié)合雙抗原夾心法檢測1.選擇HPR標(biāo)記抗原稀釋液:20％小牛PBST降低非特異性吸附：加入非特性蛋白加入表面活性劑酶標(biāo)抗體稀釋液吸光度值編號稀釋液陰性1PBS0.230±0.0302PBST0.213±0.0503PBST+5%小牛血清0.137±0.0434PBST+10%小牛血清0.115±0.0555PBST+20%小牛血清0.015±0.0306PBST+30%小牛血清0.012±0.040（二）TP抗體的免疫學(xué)結(jié)合（二）TP抗體的免疫學(xué)結(jié)合2.優(yōu)化免疫反應(yīng)時(shí)間包被抗原、待檢抗體、酶標(biāo)抗原的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡反應(yīng)，分別考察反應(yīng)時(shí)間為10、15、25、30、40、50min時(shí)的檢測結(jié)果時(shí)間(min)吸光度值陽性對照陰性對照3.選擇包被抗原濃度

2.5μg/mg、5μg/mg、7.5μg/mg、10μg/mg、12.5μg/mg、15μg/mg

×HRP√HRPHRP×抗原包被量（μg/mg）發(fā)光信號（二）TP抗體的免疫學(xué)結(jié)合

2.5

5

7.51012.515

4.選擇HPR標(biāo)記抗原的濃度

2.557.51012.5151:2000PN0.7850.0241.2870.0091.2400.0201.6800.0231.5640.0111.6700.0101:3000PN0.8550.0181.1570.0131.2830.0001.2720.0101.4930.0231.2830.0001:4000PN0.6530.0051.0200.0171.0260.0151.0700.0001.2840.0281.0780.0111:5000PN0.6640.0150.8630.0180.8880.0020.9700.0010.9460.0050.8360.0301:6000PN0.5110.0100.7330.0130.6990.0020.7980.0210.6800.0070.6260.017（二）TP抗體的免疫學(xué)結(jié)合酶標(biāo)抗體稀釋度抗原包被量最佳工作條件:TP抗原包被量為5μg/mg酶標(biāo)抗原為1:3000稀釋（三）化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化1.選擇反應(yīng)體系Tris陽性陰性發(fā)光太弱CBS陽性陰性均發(fā)光HRPLuminolH2O2PIPabTris體系發(fā)光結(jié)果相對光子數(shù)時(shí)間（s）陽性陰性abab相對光子數(shù)時(shí)間（s）陽性陰性ab

CBS體系發(fā)光結(jié)果PBS陽性發(fā)光，陰性不發(fā)光PBST陽性發(fā)光，陰性不發(fā)光PBS體系發(fā)光結(jié)果ab相對光子數(shù)時(shí)間（s）陽性陰性abab相對光子數(shù)時(shí)間（s）陽性陰性abPBST體系發(fā)光結(jié)果（三）化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化（三）化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化2.緩沖體系中Tween-20濃度的影響Tween20濃度(v/v)發(fā)光信號吐溫0.3％0.2％0.15％0.1％0.05％0.0％陽性75922852369296131661989陰性383838304630空光劑7676918411484（三）化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化3.選擇pH值pH6.577.588.5陽性129592280946551352陰性883011499空白8882323發(fā)光劑88815152pH值發(fā)光信號（三）化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化4.選擇luminol濃度1.25×10-31×10-30.75×10-30.5×10-30.25×10-3陽性2856534487332122933921648陰性7684535330空白3838382315發(fā)光劑3112581671441215×10－3、1×10-3、2×10-4、4×10-51.25×10-3、1×10-3、0.75×10-3、0.5×10-3、0.25×10-32×10－3、1.5×10-3、1×10-4、0.5×10-5Luminol濃度（mol/L）相對光子數(shù)（三）化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化5.選擇H2O2濃度1.81.51.20.90.60.3陽性180019132392262723311192陰性463023232323空白38382315158發(fā)光劑5361613830152.4、2.0、1.6、1.2、0.8、0.41.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.31.4、1.2、1、0.8、0.6、0.4H2O2濃度(μl/mL)發(fā)光信號（三）化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化6.選擇PIP濃度6×10-35×10-34×10-33×10-32×10-31×10-3陽性249129013121321228701450陰性383838304630空白1588232312發(fā)光劑6161658484911×10－2、2×10-3、4×10-4、8×10-5、1.6×10-56×10-3、5×10-3、4×10-3、3×10-3、2×10-3、1×10-510×10-3、5×10-3、2.5×10-3、1.25×10-3、0.6×10-3PIP濃度(mol/mL)發(fā)光信號＋HRP化學(xué)發(fā)光Luminol,H2O2,PIP＋HRPAg-Ab-酶復(fù)合物（四）磁酶免化學(xué)發(fā)光方法的建立及評價(jià)1.磁酶免化學(xué)發(fā)光法標(biāo)準(zhǔn)曲線測定R2=0.9988陽性血清梯度稀釋發(fā)光信號（四）磁酶免化學(xué)發(fā)光法的建立及評價(jià)將陽性血清梯度稀釋，線性關(guān)系良好y=10406x-4.619（四）磁酶免化學(xué)發(fā)光法的建立及評價(jià)2.磁酶免化學(xué)發(fā)光法與其他方法靈敏度的比較以金磁微粒為固相載體進(jìn)行酶免檢測，靈敏度提高2倍。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測，靈敏度可提高16倍。陽性血清稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果商品化試劑盒磁酶免法磁酶免化學(xué)發(fā)光法1:25+++1:50+++1:100+++1:200+++1:400-++1:800-+-+1:1600--+1:3200--+1:6400--+-1:12800---（四）磁酶免化學(xué)發(fā)光法的建立及評價(jià)3.磁酶免化學(xué)發(fā)光檢測方法的精密度在線性范圍內(nèi)選取1:400稀釋的陽性血清，重復(fù)測定11次，計(jì)算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=5.5%。

磁分離化學(xué)發(fā)光免疫法檢測陽性樣品11次重復(fù)測定相對光子數(shù)五：全文總結(jié)優(yōu)化磁酶免反應(yīng)條件優(yōu)化化學(xué)發(fā)光條件制備免疫磁珠包被時(shí)間的選擇選擇抗原包被量選擇磁粒用量優(yōu)化封閉反應(yīng)條件封閉劑的選擇HPR標(biāo)記抗原稀釋液的選擇優(yōu)化免疫反應(yīng)時(shí)間選擇抗原包被濃度選擇HPR標(biāo)記抗原的濃度選擇反應(yīng)體系緩沖體系中Tween-20