第五章常見色譜分離技術(shù)

第五章常見色譜分離技術(shù)第一節(jié)緒論第二節(jié)薄層色譜法第三節(jié)紙色譜第四節(jié)經(jīng)典柱液相色譜法及干柱層析2023/2/415.1緒論5.1.1色譜發(fā)展史及進(jìn)展1、色譜法的出現(xiàn)

1903年俄國植物學(xué)家Tswett(茨維特)把干燥的碳酸鈣粉末裝到一根細(xì)長的玻璃管中，然后把植物葉子的石油醚萃取物倒到管中的碳酸鈣上，萃取液中的色素就吸附在管內(nèi)上部的碳酸鈣里，再用純凈的石油醚洗脫被吸附的色素，于是在管內(nèi)的碳酸鈣上形成了色帶。當(dāng)時(shí)Tswett把這種色帶叫作“色譜”（Chromatography）。在這一方法中把色譜管叫作“色譜柱”，碳酸鈣叫作“固定相”，純凈的石油醚叫作“流動相”。

2023/2/422、色譜法的發(fā)展

在Tswett提出色譜概念后的20多年里沒有人關(guān)注這一偉大的發(fā)明。

1931年：德國的Kuhn和Lederer在Tswett實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-，β-，和γ-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種這類色素。

1940年：Martin和Synge提出液-液分配色譜法（Liquid-LiquidPartionChromatography）,即固定相是吸附在硅膠上的水，流動相是某中有機(jī)溶劑。

1941年Martin和Synge提出用氣體代替液體流動相的可能性。

1952年James和Martin發(fā)表了從理論到實(shí)踐比較完整的氣液色譜方法（Gas-LiquidChromatography），因而獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎。

1957年Golay開創(chuàng)了開管柱氣相色譜法（Open-TubularColumnChromatography），習(xí)慣上稱為毛細(xì)管氣相色譜法（CapillaryColumnChromatography）。2023/2/431956年VanDeemter等在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過程的速率理論，1965年Giddings總結(jié)和發(fā)展了前人的色譜理論，為色譜的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。1944年Consden等就發(fā)展了紙色譜。

1949年Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合計(jì)制作薄層板使薄層色譜（TLC）得以實(shí)際應(yīng)用，而在1956年Stahl開發(fā)出薄層色譜板涂布器之后，才使TLC得到廣泛地應(yīng)用。

20世紀(jì)60年代末，把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromatography）。

20世紀(jì)80年代初毛細(xì)管超臨界流體色譜得到發(fā)展，但在90年代后未得到較廣泛應(yīng)用。

20世紀(jì)80年代初由Jorgenson等集前人經(jīng)驗(yàn)而發(fā)展起來的毛細(xì)管電泳，在90年代得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。同時(shí)集高效液相色譜和毛細(xì)管電泳優(yōu)點(diǎn)的毛細(xì)管電色譜在90年代后期受到重視。

21世紀(jì)色譜科學(xué)將在生命科學(xué)等前沿科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮他不可替代的重要作用。2023/2/44包括兩相（即固定相、移動相）和樣品。固定相在色譜過程中不發(fā)生移動。材料：固體（相）、固體及其所支持的液體。

流動相在色譜過程中不停地移動，并帶動被分離物質(zhì)一起移動。材料：氣體、液體。樣品溶質(zhì)5.1.2色譜體系2023/2/45色譜法的基本原理色譜法是包括一大類操作方式不同、但分離原理相同的一門技術(shù)，不論采用何種方法或設(shè)備、其色譜過程有著如下共同點(diǎn)：（1）任何色譜過程，都必須有兩相物質(zhì)存在，一為固定相，一為流動相。（2）物質(zhì)的分離還必須借助于流動相相對于固定相移動。（3）被分離的物質(zhì)稱為溶質(zhì)，由于各種溶質(zhì)組分與兩相物質(zhì)有著不同作用力，從而造成各組分產(chǎn)生差速運(yùn)動而達(dá)到分離目的。溶質(zhì)與兩相物質(zhì)之間作用力可以為吸附力，也可以為溶解力；由于此種力之不同，決定了各個(gè)組分在兩相中有著不同量或濃度的分布，隨著流動相的前移，則此種分布不斷變更，最終與流動相作用力大的組分前移快，反之則慢，下圖為一二元組分分離示意圖。2023/2/46下圖為一二元組分分離示意圖。2023/2/47分離原理在色譜分析中，當(dāng)流動相攜帶樣品通過色譜的固定相時(shí)，樣品分子與固定相分子之間發(fā)生相互作用，使樣品分子在流動相和固定相之間進(jìn)行分配。與固定相分子作用越大的組分向前移動速度越慢，與固定相分子作用越小的組分向前移動速度越快，經(jīng)過一定的距離后，由于反復(fù)多次的分配，使原本性質(zhì)（沸點(diǎn)、極性等）差異很小的組分之間可得到很好的分離。2023/2/485.1.3色譜法的分類（依據(jù)不同,分發(fā)不同）（1）按兩相的狀態(tài)分類2023/2/49開床式色譜紙色譜（利用濾紙作固定相的支持物，把試樣點(diǎn)在濾紙上，用溶劑將其展開而進(jìn)行分離）薄層色譜（用粉末吸附劑，壓成或涂成薄層，然后用類似紙色譜的操作進(jìn)行分離）（2）按分離“床”的幾何形狀分類柱色譜2023/2/410（3）按分離原理分類①吸附色譜：利用吸附劑表面對不同組分具有的不同吸附能，達(dá)到分離目的。②分配色譜：利用不同組分在給定的兩相中具有不同的分配系數(shù)而使混合物實(shí)現(xiàn)分離與測定的方法。③離子交換色譜：以帶固定電荷的離子交換劑作固定相，用于分離帶相反電荷的物質(zhì)。由于不同物質(zhì)帶電情況不同而對固定相有不同的靜電力而進(jìn)行分離。④凝膠色譜：又叫體積排陽色譜，分子篩色譜。以多孔的固體凝膠作固定相，分子大小不同的物質(zhì)因進(jìn)入固定相孔內(nèi)的程度不同而達(dá)到分離的目的。⑤親合色譜：根據(jù)固定相上鍵合的特殊配體對某種生物大分子有專一性吸附而除去其他雜質(zhì)。使生物大分子得以分離。2023/2/411（4）按使用領(lǐng)域不同對色譜的分類：①分析型色譜：主要用于各種樣品的分析，其特點(diǎn)是色譜柱較細(xì)，分析的樣品量少。②制備型色譜：又可分為實(shí)驗(yàn)室用制備型色譜和工業(yè)用大型制造純物質(zhì)的制備色譜。

2023/2/4125.2薄層色譜法薄層色譜法（Thin-LayerChromatography，簡稱TLC）定義：是一種把固體分離材料鋪在一個(gè)固體薄片上形成薄層，通過移動相流經(jīng)薄片上附著的吸附劑，帶動試樣逐漸上升(展開)，由于混合物組分對固定相、移動相相對吸附能力的不同而將其加以分離的方法分類：薄層色譜法可以有多種形式：如吸附色譜，分配色譜，離子交換色譜等，而應(yīng)用最廣泛的是吸附薄層色譜，所以在這里只討論它。2023/2/4135.2.1基本原理基本概念：吸附：溶質(zhì)分子隨流動相之流動，會貼在固定相表面上，這就是吸附。物理吸附：吸附作用力為分子間的一般作用力，即范德華力，沒有化學(xué)鍵的生成與破壞。因之物理吸附具有普遍性，無選擇性；吸附速度快而可逆；同時(shí)吸附熱較?。?~10千卡/摩爾）；被吸附分子不限于單層，實(shí)際上可以是多層。2023/2/414化學(xué)吸附：吸附作用力類似化學(xué)鍵力；即電子的轉(zhuǎn)移或電子共用等。由于被吸附分子與吸附劑分子間有成鍵的可能，所以有選擇性，吸附速度較慢，需要在高溫下才能發(fā)生；不易解析；吸附熱較大（10~100千卡/摩爾），被吸附分子一般是單層的。物理吸附與化學(xué)吸附可以并行發(fā)生，二者不是截然無關(guān)的。吸附劑：吸附別的物質(zhì)的物質(zhì)。如：硅膠、三氧化二鋁。展開劑：溶劑，又叫洗脫劑，帶動樣品移動。樣品：又叫溶質(zhì)。2023/2/415基本原理在吸附薄層色譜體系中，一般均發(fā)生物理吸附。當(dāng)樣品溶液被點(diǎn)樣到薄板的吸附劑上然后用展開劑展開時(shí)，吸附劑對樣品分子、溶劑分子均發(fā)生吸附。同時(shí)，它們也都可以被解吸下來（即吸附在某一點(diǎn)上的分子被其他分子所取代）。2023/2/416在薄層色譜的展開過程中，溶質(zhì)分子和溶劑分子對吸附劑存在著一個(gè)競爭。被吸附在薄板上的溶質(zhì)分子可以被溶劑分子置換進(jìn)入溶劑中，并隨溶劑的向前移動而遷移。而在溶劑中的溶質(zhì)分子也可以把吸附在吸附劑上的溶劑分子置換下來，溶質(zhì)分子重新被吸附在吸附劑上。這一過程不斷循環(huán)往復(fù)進(jìn)行。對于吸附性強(qiáng)的溶質(zhì)組分在吸附劑上的濃度大一些；吸附弱的溶質(zhì)組分則在溶液中濃度大。吸附弱or在溶液中濃度大的組分，隨溶劑的前進(jìn)遷移速度快，則Rf值大；反之吸附強(qiáng)or在溶液中濃度小的組分隨溶劑的前進(jìn)遷移速度慢，則Rf值小。這樣就可以把不同的組分分離開。2023/2/417溶質(zhì)遷移的快慢用比移值Rf來表示

在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，Rf值對于某一溶質(zhì)說是一特征值，因此可借色譜法來鑒定物質(zhì)。吸附力強(qiáng)的溶質(zhì)，有較小的Rf值，反之，則有較大的Rf值。Rf這一特征值就構(gòu)成了色譜分析的基礎(chǔ)。2023/2/4185.2.2薄層色譜的固定相1.確定吸附劑從被分離混合物性質(zhì)出發(fā)主要考慮3個(gè)方面—溶解性；酸堿性；極性。①溶解性：2023/2/419②酸堿性：吸附劑酸堿性與試樣的應(yīng)保持一致。否則會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生不可逆吸附。一般地：硅膠—略帶酸性。(適用于酸性和中性物質(zhì)的分離)氧化鋁—略帶堿性。(適用于堿性和中性物質(zhì)的分離)硅膠與氧化鋁以1：1量慘和—中性吸附劑。③極性:

吸附劑一般都是極性物質(zhì)，所以混合物試樣的極性越大，則被吸附劑吸附得越牢，移動速度越慢（Rf值越小）2023/2/420常見吸附劑吸附能力的比較：蔗糖＜纖維素＜淀粉＜CaCO3

＜CaSO4＜MgCO3

＜硅膠＜活性炭＜MgO＜氧化鋁（2）吸附力的規(guī)律性：被吸附分子與吸附劑（硅膠、氧化鋁）之間的吸附力大小有下列規(guī)律性:①能在吸附劑和吸附分子間形成氫鍵時(shí)，吸附力就大。②被吸附分子的極性大，吸附力就大；分子中極性官能團(tuán)增多，吸附力也增加。③分子中有雙鍵時(shí)吸附力比無雙鍵時(shí)大，雙鍵增大，特別是形成共軛時(shí)吸附力增大的更明顯。苯環(huán)的影響比雙鍵大。④同系物中分子量大則吸附作用也強(qiáng)。2023/2/421⑤同分異構(gòu)體若形成了分子內(nèi)氫鍵，則對吸附劑的吸附力大大減小，如下列物質(zhì)的吸附力大小為：⑥含單官能團(tuán)的化合物，當(dāng)烷基鏈長短相同時(shí)，吸附力大小為:離子化合物＞羧酸＞醇、酰胺＞伯胺＞酯、醛酮＞腈、叔胺、硝基化合物＞醚＞烯＞鹵代烷＞烷2023/2/422（3）吸附劑選用

吸附色譜：

?最常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁，粒度一般為150—300目篩孔，其次是聚酰胺和纖維素，其粒度一般分別為70—140目篩孔和160—200目篩孔。

?氧化鋁的極性比硅膠大，比較適用于分離極性較小的化合物（烴、醚、醛、酮、鹵代烴等）；相反，硅膠適用于分離極性較大的化合物（羧酸、醇、胺等），而非極性化合物在硅膠板上吸附較弱，分離較差，Rf值較大。2023/2/423表5-1常見薄層色譜吸附劑（固定相）固定相性質(zhì)參考用途硅膠表面有硅羥基，弱酸性PH4.5分離酸、中性物質(zhì)，如：酚類、醛類、生物堿類、甾體化合物及氨基酸類氧化鋁表面暴露的鋁原子，Al-O鍵具有吸附作用堿性氧化鋁分離中性或堿性化合物，如：多環(huán)碳?xì)浠衔镱?、生物堿類、胺類、脂溶性維生素及醛酮類；中性氧化鋁分離酸及對堿不穩(wěn)定化合物；酸性氧化鋁分離酸性化合物。聚酰胺分子內(nèi)酰胺基能與某些基團(tuán)形成氫鍵分離酚類、酸類、醌類及硝基化合物。纖維素有大量羥基親水基團(tuán)，親水性很強(qiáng)分離親水性化合物，如：氨基酸、核苷酸衍生物、糖等，分析蛋白質(zhì)，肽以及多糖、核苷酸等。2023/2/4242.薄層色譜對吸附劑的要求①具有均勻的結(jié)構(gòu)和一定的比表面積。②具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。對展開劑和樣品成分不分解、不破壞。③具有可逆的吸附性。④最好為白色固體，以利于觀測。注意：堿性氧化鋁做吸附劑時(shí)，會引起一些物質(zhì)的反應(yīng)。如：使醛酮縮合、酯和內(nèi)酯水解、醇羥基脫水。2023/2/4255.2.3薄板的制備：1、薄板制備：（1）薄板的選擇最常用的薄板是玻璃板，其大小選擇：根據(jù)目的、樣品量、組分的數(shù)目多少和展開的方式等綜合而定。小量制備：待分離組分總量在0.5－1g左右，可采用400mm×350mm的薄板1－3塊即可。預(yù)試或定性分析：用單項(xiàng)展開時(shí)，多用載玻片（200mm×50mm，200mm×25mm或75mm×25mm）。雙向展開或小量制備時(shí)，一般采用200mm×200mm或400mm×200mm的大板。玻璃板要求：平整、光滑、干凈。2023/2/426（2）制板方法：濕鋪法和干鋪法干鋪法概念：就是將吸附劑顆?；蚍勰┚鶆虻仄戒佋诓ＡО迳系姆椒ǎ频帽“宸Q為干板。吸附劑粒度要求：一般為150－200目左右。涂鋪方法：把玻璃板平放在平臺上或?qū)嶒?yàn)臺面上，先將吸附劑大致平攤在玻板上，然后兩手握住一根帶有兩個(gè)套圈的粗玻璃棒，按照圖所示方向推動，把多余的吸附劑除去，便可得到一塊均勻的薄板。玻棒套圈可以用塑料管或膠布等制成。兩個(gè)套圈的厚度和距離，便是薄層的厚度和寬度。定性或定量板厚度：0.25－0.5mm；制備板厚度：1-3mm（此法也可用于制備大塊濕板）。2023/2/427圖5－1薄層干鋪法1－玻板2－玻棒3－厚層套圈

4－導(dǎo)軌套圈5－薄層2023/2/428濕鋪法概念：將溶劑或含粘合劑的溶劑和吸附劑按一定的比例，[一般硅膠為30g/(75-90)ml，氧化鋁為25g/50ml]，加到一起，調(diào)成糊狀，然后再將糊狀物均勻的鋪在薄板上的方法。吸附劑粒度要求：硅膠、氧化鋁一般為200－300目左右；聚酰胺、纖維素一般為160－200目。濕鋪法的操作步驟：①調(diào)糊硅膠G、氧化鋁G、硅膠GF254或不含粘合劑的吸附劑如硅膠H、氧化鋁H的充分調(diào)勻，均是取1份吸附劑，加入2-3份水。用CMC作粘合劑：0.5%羧甲基纖維素鈉溶液100ml,加硅膠H（200－250目）30g或氧化鋁50g，充分調(diào)勻后，即可涂鋪。2023/2/429用淀粉作粘合劑時(shí)：取硅膠H（200－250目）0.95份，加0.05份淀粉（可溶性淀粉不能用），加水2－3份，將容器放在沸水浴上加熱，不停攪拌下煮沸5分鐘，直到獲得最大的粘稠度，再加水1份，再煮1－2min，調(diào)勻，冷后涂鋪。纖維素粉作粘合劑：纖維素粉1份，加水（或丙酮）5－6份調(diào)成糊狀后涂鋪。聚酰胺1g，加6mL85%甲酸，攪拌溶解后，再加70%乙醇3mL，調(diào)勻后，便可涂鋪。2023/2/430②徒手鋪板：將調(diào)制好的薄層糊倒在備用的玻板上，用玻棒初步攤開，用拇指和食指抓住玻板一端，在桌面上反復(fù)震動數(shù)次，待薄層糊鋪展均勻后，平放在平臺上即可。此法簡便、快速，最適合微型板的制備。③薄層板質(zhì)量的判定：薄厚均勻，層面不應(yīng)有波紋，也不應(yīng)有透過吸附劑而看到玻璃板的斑點(diǎn)。④薄板的后處理：晾干后，活化。硅膠板一般在105℃,最高不超過128℃

，烘箱中烘烤半小時(shí)，冷卻后取出在干燥器中保存?zhèn)溆谩Ｗ鳛榉峙渖V的硅膠薄層板無需活化，在室溫下放置12h－24h后即可使用；氧化鋁板200－220℃活化4h，得活性為Ⅱ級的板。150－160℃

活化4h，得活性為Ⅲ－Ⅳ級的板。2023/2/4312、薄板（吸附劑）活性測定：（1）海氏（Hermenek）法適用對象：無粘合劑氧化鋁和硅膠板方法：取0.02mL染料混合液，分別滴于氧化鋁（或硅膠）干板上（薄層：90×240×0.6mm），用四氯化碳展開（薄板與展開缸底夾角為10－20℃）。然后按下表中Rf值確定其活度級別。2023/2/432表5－2氧化鋁及硅膠海氏定級法2023/2/433（2）斯托爾（Stahl）方法適用對象：用濕鋪板、經(jīng)活化的含粘合劑的硅膠板方法：將三種染料的混合氯仿溶液點(diǎn)在薄層上，點(diǎn)的直徑為1－2mm，用正己烷∶乙酸乙酯（9∶1）展開，30－60min內(nèi)溶劑爬行10cm，如果三種染料的比移值（Rf）大小為對二甲氨基偶氮苯>靛酚藍(lán)>蘇丹紅，則與Ⅱ級氧化鋁的活性相當(dāng)。2023/2/4345.2.4點(diǎn)樣及展開1、點(diǎn)樣：將樣品溶液點(diǎn)在薄板上。點(diǎn)樣工具：微量注射器；玻璃毛細(xì)管。點(diǎn)樣方法：液體直接點(diǎn)樣法；固體添埋法。樣點(diǎn)式樣：點(diǎn)型；線型；條型。點(diǎn)樣應(yīng)注意的五個(gè)問題：點(diǎn)樣液的濃度與制備：5%準(zhǔn)備液0.1～1%點(diǎn)樣液重復(fù)點(diǎn)樣的次數(shù)與操作事項(xiàng)：點(diǎn)樣斑點(diǎn)的大?。阂话泓c(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不大于3mm；點(diǎn)樣量：0.25mm薄層，一般點(diǎn)樣量為幾微克～幾百微克作定性分析；2mm層厚，點(diǎn)樣量可達(dá)幾十毫克～幾百毫克作制備。點(diǎn)樣位置：距底邊約1.5－2cm的起始線上，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離一般為1.5－2cm。2023/2/435圖5－2各種點(diǎn)樣方式示意圖2023/2/4362023/2/4372、展開/展層：是混合物樣品分離的過程。應(yīng)注意：①展開劑不淹沒樣點(diǎn)。②薄板呈傾斜狀③溶劑前沿不超過板頂。展層的容器：除了專用的色譜缸外，常見玻璃標(biāo)本缸、染色缸、廣口瓶、大量筒、大試管等可作為其代用品。展層方式：上行法；下行法；雙向法；遞次上行法。2023/2/438（1）上行法：有傾斜上行法或垂直上行法兩種。軟板則只能與平面成約15℃的近水平傾斜放置。上行法展開的距離一般為10－15cm，展開時(shí)間約為30min左右，最快者只需幾分鐘，最慢者需2－3h。2023/2/439（2）下行法：薄層樣點(diǎn)朝上，展開劑是從上向下通過薄層。展開劑與薄層之間是通過濾紙條或紗布條作為橋梁進(jìn)行轉(zhuǎn)移的。由于展開劑受吸附和重力的雙重作用，因此，下行法展開速度較快。（3）雙向展開法：適用于方形板。先沿X軸展開，然后再換用另外一種展開劑沿Y軸展開。此法常用于某些復(fù)雜成分或Rf值較小的成分的展開，氨基酸分離就常用此法展開。原點(diǎn)122023/2/440（4）遞次單向法/多次單向法：先用一種展開劑上行展開后，再在同一方向用同一種或換成另外一種展開劑展開，如此反復(fù)多次，可得到較好的分離效果，這種方法稱為遞次上行法，可適用于不易分離的化合物的分離。邊緣效應(yīng)：消除邊緣效應(yīng)的方法：是在層析缸內(nèi)壁貼上用展開劑浸濕的濾紙條。2023/2/4413、展開劑的選擇：即：一是展開劑對被分離物質(zhì)應(yīng)該有一定的解吸能力，即要選擇合適的極性。極性大的溶劑，解吸能力（或叫洗脫能力）強(qiáng)，樣品組分的Rf值大；極性小的溶劑，解吸能力小，使組分的Rf也小。二是展開劑對被分離的組分有一定的溶解度，因?yàn)楸唤馕聛淼慕M分只有能溶解在展開劑中才能隨展開劑向前移動。大原則：選擇展開劑一般需要針對吸附劑的種類、活度和被分離混合物的組成及各成分的性質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等情況綜合而定2023/2/442小原則：被分離物質(zhì)和展開劑之間的極性關(guān)系應(yīng)符合“相似相溶原理”。該原則可用于確定展開劑的大致范圍。即：強(qiáng)極性試樣用強(qiáng)極性展開劑；弱極性試樣用弱極性展開劑。選擇的具體方法：

粗選→預(yù)試驗(yàn)（微園環(huán)試驗(yàn)和小板試驗(yàn)）→確定2023/2/4432023/2/444硅膠和氧化鋁板上官能團(tuán)對洗脫能力的影響是：（弱→強(qiáng)）

若溶劑分子中有以上官能團(tuán)，則越往后的官能團(tuán)溶劑，洗脫時(shí)解吸能力越大，Rf越大。某些溶劑的洗脫能力/極性大小，見下：2023/2/445單一溶劑的極性大小順序?yàn)椋菏兔眩ㄐ。h(huán)己烷→四氯化碳→三氯乙烯→苯→甲苯→二氯甲烷→氯仿→乙醚→乙酸乙酯→乙酸甲酯→丙酮→正丙醇→甲醇→吡啶→乙酸（大）混合溶劑的極性順序：苯∶氯仿（1+1）→環(huán)己烷∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶丙酮（95+5）→苯∶丙酮（9+1）→苯∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶乙醚（9+1）→苯∶甲醇（95+5）→苯∶乙醚（6+4）→環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶乙醚（8+2）→氯仿∶甲醇（99+1）→苯∶甲醇（9+1）→氯仿∶丙酮（85+15）→苯∶乙醚（4+6）→苯∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶甲醇（95+5）→氯仿∶丙酮（7+3）→苯∶乙酸乙酯（3+7）→苯∶乙醚（1+9）→乙醚∶甲醇（99+1）→乙酸乙酯∶甲醇（99+1）→苯∶丙酮（1+1）→氯仿∶甲醇（9+1）2023/2/446如何根據(jù)被分離的對象選擇吸附劑和展開劑？一般地：都是根據(jù)樣品極性及試驗(yàn)結(jié)果臨時(shí)確定的。若吸附劑確定后，經(jīng)試驗(yàn)若：Rf值太大，選展開劑極性比原來的小的溶劑。Rf值太小，選展開劑極性比原來的大的溶劑。一般經(jīng)過多次才能確定下來。有一三角形圖解法可以作為初步選擇參考。2023/2/447圖5-3吸附色譜中三種主要因素的關(guān)系圖2023/2/4485.2.5顯色顯色：為再現(xiàn)無色組分斑點(diǎn)位置。目的：對物質(zhì)進(jìn)行鑒定。方法：物理方法－紫外光照射?；瘜W(xué)方法－化學(xué)試劑噴灑。噴灑工具及方法：噴壺；噴灑顯色劑要求噴壺與薄層的距離應(yīng)在約30—40厘米，顯色后，要立即用鉛筆或打頭針把斑點(diǎn)位置標(biāo)出，以便下步測量Rf值，并把薄層色譜圖描繪下來。

噴壺2023/2/449顯色劑種類：介紹幾種化學(xué)方法：（顯色前要將展開劑<溶劑>揮發(fā)掉）1、碘蒸氣法將展開后溶劑揮發(fā)干的薄板放入一個(gè)密閉的容器內(nèi)。容器是碘蒸氣飽和的器皿。多數(shù)有機(jī)物可以顯黃到黃棕色斑點(diǎn)。顯色作用是碘溶解在組分中，或被吸附在組分物質(zhì)上或與組分發(fā)生加成作用，主要是吸附作用。所以顯色后在空氣中放置碘會揮發(fā)，斑點(diǎn)褐色，有利于應(yīng)用在制備薄層色譜。通用顯色劑；選擇性顯色劑；專屬性顯色劑。2023/2/4502、噴霧顯色將可以與分離的物質(zhì)反應(yīng)生成有色物質(zhì)的顯色劑配成一定濃度的溶液，用噴霧器均勻地噴在薄層板上進(jìn)行顯色。常用的通用性顯色劑如下：a.重鉻酸鉀——硫酸（5g重鉻酸鉀溶于100mL40%硫酸中）：用于檢查一般有機(jī)物。b．熒光素——溴（0.1g熒光素溶于100mL乙醇）：噴后放在有5%的Br2—CCl4缸中熏，在紫外燈下觀察。用于不飽和化合物。c．硫酸：配成5%的硫酸乙醇溶液或15%硫酸正丁醇溶液或濃硫酸——醋酸（1：1）的溶液。這是一種通用顯色劑。噴后放置15min，然后110℃下烘到顯色。d．磷鉬酸（或磷鎢酸、硅鎢酸）：噴灑劑為5%—10%的磷鉬酸乙醇溶液，用于檢查還原性物質(zhì)、生物堿、甾體。噴后加熱到120℃到斑點(diǎn)出現(xiàn)。2023/2/4513、吸附劑加熒光粉樣品是有機(jī)物且含有共軛基團(tuán)可以吸收紫外線時(shí)，其薄層分析可以事先在吸附劑中加熒光粉，制成的薄板在紫外燈下顯一片熒光。展開后，揮發(fā)干溶劑的薄板，其組分斑點(diǎn)因吸收紫外線而顯暗色斑點(diǎn)，其余地方仍顯熒光。這是一種對共軛基團(tuán)的物質(zhì)的最方便的顯色辦法。2023/2/4525.2.6定性分析及定量分析1、定性分析：以組分的比移值（Rf值）為依據(jù)，即在相同的條件下相同物質(zhì)有相同的Rf值，不同物質(zhì)有不同的Rf值。比移值：溶質(zhì)的運(yùn)動速度與展開劑的運(yùn)動速度之比值。注意：Rf值與許多因素有關(guān)。（1）比移值2023/2/453薄層色譜的Rf值2023/2/454①影響Rf值的因素：薄層的厚度吸附劑的種類、粒度、活度（吸附能力）展開劑的純度、組成及揮發(fā)性展開方式（上行或下行）展開缸的形狀、大小及缸內(nèi)溶劑的飽和程度取樣量大?。ㄈ恿看?，斑點(diǎn)拖尾，Rf較?。┩饨鐪囟龋囟茸兓扔绊懭軇┑膿]發(fā)性，又影響吸附平衡）邊緣效應(yīng)（即同一樣品，點(diǎn)在薄板中部的比兩邊的Rf?。?023/2/455②Rf的特性和應(yīng)用：在固定條件下，特定化合物的Rf值是一個(gè)常數(shù)。因此，在條件完全相同的情況下，Rf值可以作為該化合物定性鑒定的物理指標(biāo)，就像測定熔點(diǎn)或其它物理常數(shù)一樣。為了獲得相同的色譜條件，通常是把未知樣和標(biāo)準(zhǔn)樣同時(shí)滴加在同一塊薄板上。③Rf的測量Rf值測量：斑點(diǎn)輪廓→斑點(diǎn)重心位置→斑點(diǎn)中心到點(diǎn)樣原點(diǎn)距離→展開劑前沿到點(diǎn)樣原點(diǎn)距離→Rf值計(jì)算2023/2/456（2）TLC定性分析的幾種方法①將樣品的Rf

值與標(biāo)樣的Rf

相比較：由于影響Rf值的因素很多，常需要在使用兩種以上不同組成的展開劑而得到的Rf值與標(biāo)樣的Rf值一致時(shí)，才認(rèn)定該斑點(diǎn)與標(biāo)樣是同一化合物。②將斑點(diǎn)的顯色特性與標(biāo)樣的顯色特性相比較：確定化合物性質(zhì)。③使用斑點(diǎn)的原位掃描：展開后的斑點(diǎn)用薄層掃描儀作原位掃描可得該斑點(diǎn)的掃描圖，當(dāng)其吸收峰及最大吸收波長與標(biāo)樣一致時(shí)，可認(rèn)為是同一物質(zhì)。④與其他方式聯(lián)用：將薄層分離后得到的單一斑點(diǎn)收集、洗脫，然后使用GC、HPLC、紫外、紅外等方法幫助鑒定。2023/2/4572、定量分析（1）洗脫法展開后的薄板，選擇某種不影響下步定量操作的顯色方法進(jìn)行顯色，如碘蒸氣法顯色。然后刮下需要定量的組分的標(biāo)準(zhǔn)樣的斑點(diǎn)和待測樣對應(yīng)組分的斑點(diǎn)。分別用溶劑萃取，然后用紫外光譜或熒光光譜（只適用于有熒光的化合物）進(jìn)行定量，也可以使用氣相色譜或液相色譜定量。薄層色譜分離后用分光光度法測定，方法誤差約在2%-6%。（間接法測定－－斑點(diǎn)物質(zhì)分離→準(zhǔn)確定溶→儀器測定，誤差在3～5%之間。）2023/2/458（2）薄層掃描定量法2023/2/459掃描儀掃描方式：線性掃描和鋸齒掃描線性掃描：用一束比斑點(diǎn)略長的光束對斑點(diǎn)作單向掃描。鋸齒掃描：用微小的正方形光束對斑點(diǎn)沿X方向進(jìn)行鋸齒形掃描，同時(shí)也沿Y方向緩慢地掃描，能測定斑點(diǎn)的全部面積。在組分斑點(diǎn)處會出現(xiàn)一個(gè)吸收峰。其記錄的是樣品吸收峰與空白峰的差。用未知樣組分的峰面積和已知標(biāo)準(zhǔn)樣的峰面積及上樣量就可以計(jì)算出待測樣品中組分的量。結(jié)果確定用未知樣組分的峰面積和已知標(biāo)準(zhǔn)樣的峰面積及上樣量就可以計(jì)算出待測樣品中組分的量。注意：薄層板制備的均勻程度對定量分析的誤差影響極大。2023/2/4605.2.7特殊型薄層色譜1、制備TLC薄層色譜可以用于小量的樣品的制備分離中。若要制備幾十毫克樣品，薄層色譜往往比柱色譜更快捷，分離效果也更佳。這時(shí)就要采用大尺寸的薄板，并且重復(fù)分離多次。薄板的尺寸視展開槽而定，一般可以做成20×20cm或20×40cm。板也可以適當(dāng)厚一些，以增大每塊板的上樣量。但也要注意板做得厚了，分離效果會下降。在20×20cm，厚0.5mm的薄層板上可以分離10-50mg樣品。點(diǎn)樣方法也與分析型不同，不是點(diǎn)成一個(gè)點(diǎn)，而是沿薄板一邊的1.5cm處，與此邊平行地點(diǎn)成一條線，而且盡量點(diǎn)均勻。展開后，樣品每一個(gè)組分出現(xiàn)一條帶狀。顯色后，把所需組分對應(yīng)的一條帶括下，萃取，濃縮，收集。2023/2/4612、燒結(jié)薄層色譜這是一種多次使用的薄層板，一般薄層板容易造成吸附層脫落，不易攜帶，而且只能用一次?，F(xiàn)有商品化的燒結(jié)薄層色譜板，吸附層燒結(jié)在玻璃板或高聚物板上（是由200~300石英或玻璃粉，與200~300目硅膠或氧化鋁按1：25重量混合，用乙醇調(diào)成漿料，涂在玻璃板上。0.25~0.3毫米厚，然后在700~780℃高溫下燒結(jié)，即成燒結(jié)板），便于攜帶，可以供定性定量用。而且使用后可以用乙醇或其它有機(jī)溶劑洗滌，最后用水先干凈后烘干再繼續(xù)使用。

分離后的組分應(yīng)在濃縮后用薄層色譜或氣相色譜或高效液相色譜作純度檢驗(yàn)。吸附劑最好在制板前用溶劑提取，以除去雜質(zhì)，避免雜質(zhì)帶進(jìn)分離后的組分中。2023/2/4623、高效薄層色譜高效薄層色譜是在原有的基礎(chǔ)上采用粒度更?。?-7μm）及粒度分布范圍更窄的吸附劑，配用特殊粘合劑制備成高效薄層色譜板來實(shí)現(xiàn)高效分離。它的特點(diǎn)是點(diǎn)樣量少，展開時(shí)間短，斑點(diǎn)集中，分辨力高，檢出下限小，達(dá)到Pg級，可供直接定量測定用。高效薄層色譜的展開時(shí)間只要3-20min，移行距離3-7cm即可獲滿意結(jié)果。2023/2/4634、旋轉(zhuǎn)TLC讓它在通入展開劑的情況下旋轉(zhuǎn)，使樣品展開而得到分離。又稱離心薄層色譜法

(centrifugal

thin

layer

chromatography)。一種旋轉(zhuǎn)離心、連續(xù)洗脫的徑向薄層色譜技術(shù)。分離原理是基于樣品在吸附劑和展開劑之間的吸附或分配作用的不同，以及離心力的作用，促使樣品各組分之間原有Rf值差異加大，因此提高了分離效果,加快分離速度。2023/2/4645.2.8TLC的特點(diǎn)方法簡便易行,價(jià)格低廉；在色譜板上檢測樣品不會丟失組分；分析快速；檢出靈敏度高；分離能力強(qiáng)；檢測手段多樣化；應(yīng)用廣泛；可選用不同種類分離材料,以適應(yīng)不同分離的需求。2023/2/4655.2.9吸附薄層色譜的應(yīng)用

吸附薄層色譜可用于定性和定量分析

(1)研究合成反應(yīng)進(jìn)行過程

(2)中草藥分離提純

(3)未知物的鑒定

(4)檢驗(yàn)物質(zhì)純度

(5)定量測定2023/2/466TLC應(yīng)用示例藥物“諾氟沙星”注射液中棕黃色沉淀物的鑒定諾氟沙星的結(jié)構(gòu):1-乙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氫-7-(1-派嗪基)-3-喹啉羧酸2023/2/467

諾氟沙星經(jīng)滅菌后，往往產(chǎn)生棕色至棕色沉淀物，影響產(chǎn)品質(zhì)量。人們應(yīng)用現(xiàn)代分離分析手段對諾氟沙星中沉淀物進(jìn)行了研究：分析手段諾氟沙星沉淀物推斷紫外兩者結(jié)構(gòu)母體相同初步認(rèn)為沉淀物為諾氟沙星的脫羧產(chǎn)物紅外羧基中有C=O強(qiáng)吸收帶基本消失質(zhì)譜確定其為諾的脫羧產(chǎn)物質(zhì)譜/核磁確證沉淀物結(jié)構(gòu)：1-乙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氫-7-(1-派嗪基)-3-喹啉

確定該沉淀物為諾氟沙星的脫羧產(chǎn)物，并對產(chǎn)生沉淀的原因進(jìn)行了分析，（結(jié)果表明：在諾氟沙星結(jié)構(gòu)中，3-位碳上的COOH，屬于β-酮酸類，它在酸性介質(zhì)中易脫羧，若有金屬離子的存在，則可加速脫羧進(jìn)程；若在酸性條件下，加溫過高，時(shí)間過長，也會加速脫羧進(jìn)程，脫羧物慢慢沉淀下來，致使注射液的透明度不合格。）這對諾氟沙星注射液以及喹諾酮類其他藥物的質(zhì)量控制有指導(dǎo)意義。2023/2/468其分析過程中有一步是薄層分析：分別取沉淀物和諾氟沙星適量，加N,N-二甲基甲酰胺制成每1ml中約含2mg的溶液，在硅膠G或硅膠GF254（加0.5%羧甲基纖維素鈉制板）薄層板上點(diǎn)樣1－3μl，在氯仿-無水甲醇-濃氨水（15∶10∶3）中展開，展距為10－13cm，置紫外燈（254nm）下檢視，結(jié)果見右圖。圖譜表明沉淀物的Rf值與諾氟沙星主斑點(diǎn)的Rf值不同。諾氟沙星及其沉淀物的薄層色譜圖A-諾氟沙星B-諾氟沙星沉淀物2023/2/4695.3紙色譜

(Paperchromatography)5.3.1基本原理紙色譜是一種以濾紙為支持物，以分配機(jī)理為主的色譜（此外，還涉及吸附和離子交換等機(jī)理），主要用于多官能團(tuán)或高極性的親水化合物如醇類、羥基酸、氨基酸、糖類和黃酮類等的分離。濾紙是由幾乎純粹纖維素構(gòu)成的。在水蒸汽飽和的空氣中，它可以吸附20～25%的水分，其中約有6～7%的吸附水是通過氫鍵與纖維素的羥基結(jié)合而結(jié)合于纖維素上，一般較難脫去。這些吸附水就構(gòu)成了色譜過程的固定相，濾紙只起到支持固定相的作用。作為分配色譜，其分離過程是依賴于萃取原理而實(shí)現(xiàn)的。2023/2/470分配色譜的原理：

相當(dāng)連續(xù)多次的液—液萃取。與吸附色譜不同的是固定相和流動相均是液體，固定相的液體由其它固體材料（支持劑、載體或擔(dān)體）來支持或載附，不隨流動相的移動而移動。因此，物質(zhì)的分離是依靠不同的物質(zhì)在固定相和流動相之間以不同的分配系數(shù)（K）連續(xù)不斷地形成分配平衡而實(shí)現(xiàn)的。

物質(zhì)在薄層板上移動速度常用Rf值（比移值）表示，其定義是：2023/2/4715.3.2濾紙的要求與選擇濾紙的要求：質(zhì)地細(xì)密，厚薄均勻，平整，對光檢測時(shí)透光度均勻，不得有污點(diǎn)，應(yīng)有一定的強(qiáng)度，濾紙對溶劑的滲透速度適當(dāng)，濾紙中不含有水溶性和有機(jī)溶劑可溶性雜質(zhì)，對氨基酸分析有干擾的銅、鐵元素的含量分別在1.5和10ppm以內(nèi)。常用濾紙：杭州新華造紙廠生產(chǎn)的定性濾紙、定量濾紙和層析濾紙（見下表），以新華1號濾紙最為普遍。如果需要加大點(diǎn)樣量，可選擇較厚的新華3號濾紙。使用進(jìn)口濾紙最多的當(dāng)屬英國造的沃特曼（Whatman）1號濾紙。濾紙的選擇：一般選擇中速濾紙。以正丁醇為主的展開劑，粘度較大，展開速度慢；以石油謎、氯仿等為主的溶劑展開速度較快?？蓳?jù)此結(jié)合實(shí)驗(yàn)要求來挑選快速、中速、慢速的濾紙。一般定性分析選用較薄的濾紙；厚質(zhì)濾紙往往作制備用。2023/2/472

濾紙裁剪及注意事項(xiàng)：需要條形狀時(shí)，應(yīng)順著纖維排列的方向。在裁剪濾紙時(shí)，要把周邊裁剪整齊，不能留毛邊。還要注意防止手垢和汗?jié)n等雜質(zhì)污染濾紙。2023/2/4735.3.3展開溶劑的選擇與配制紙色譜溶劑系統(tǒng)的要求：被分離的物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中比移值在0.05～0.85之間，而分離兩個(gè)以上的混合物，相互間比移值最好大于0.05。檢測物質(zhì)純度則比移位最好在0.4～0.6之間溶劑的任一組分均不與目標(biāo)物起化學(xué)反應(yīng)。紙層析所得斑點(diǎn)圓整，并且圓整程度不依點(diǎn)樣多少而有差異分離物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的分配比恒定，受溫度變化小，而且容易迅速達(dá)到平衡。這樣易得圓整的斑點(diǎn)，且無需恒溫的實(shí)驗(yàn)條件盡可能少用高沸點(diǎn)溶劑多元系統(tǒng)溶劑中，組成恒定，受溫度變化小2023/2/474展開系統(tǒng)的選擇原則：多用極性的混合溶劑，且其中之一是水。在選擇展開劑時(shí)，一般按照相似相溶原理進(jìn)行。如果被分離物質(zhì)是易溶于水，但難溶于乙醇的的強(qiáng)親水性的，如氨基酸、糖類等，可選用含水量在10—40%之間的高含水量系統(tǒng)作為展開劑。若物質(zhì)是可溶于乙醇和水，且較易溶于乙醇的中等親水性的，則宜采用中等含水量的溶劑系統(tǒng)作展開劑。對于難溶于水，但易溶于親脂性溶劑的物質(zhì)，則展開劑主要組分是苯、環(huán)己烷、四氯化碳、甲苯等。對于完全親脂性物質(zhì)如甾醇等，最好采用反相系統(tǒng)，即用甲酰胺、二甲基甲酰胺等浸漬濾紙作固定相，可用含水的醇或與此相近的溶劑作為流動相。混合溶劑中有機(jī)溶劑與含水量的變化規(guī)律：有機(jī)溶劑的極性越大，所配成的混合溶劑的有機(jī)相中含水量越高，反之，含水量越低。2023/2/475混合溶劑的配制特例：如果混合液分層，則必須在充分振蕩混合、靜置分層之后，分出有機(jī)相作為展開劑。分離酸性或堿性物質(zhì)時(shí)溶劑系統(tǒng)：由于酸和堿的電離平衡現(xiàn)象，展開時(shí)必將產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。因此，通常在溶劑中加入較強(qiáng)的酸（如甲酸）或堿（如氨）來抑制弱酸或弱堿的電離。另一種常用方法就是在濾紙上噴上緩沖鹽類，以保持一定的pH值，干后再展開。但必須注意，展開劑也必須事先用緩沖液平衡后再使用。2023/2/476斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象的幾種原因①點(diǎn)樣量過多，樣品量超過了點(diǎn)樣處濾紙所荷載的溶劑能夠溶解的能力。②某些物質(zhì)可以形成多個(gè)電離形式，且各自有其不同的Rf值，因而在紙上造成連續(xù)拖尾，這種情況可使用堿性或酸性的展開系統(tǒng)，抑制其電離即可消除。③被分離的物質(zhì)與濾紙上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等雜質(zhì)形成絡(luò)合物而形成拖尾，可改用純?yōu)V紙展開。④某些物質(zhì)在展開過程中會逐漸分解，如腎上腺素和某些含硫氨基酸等，可將它們轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的物質(zhì)再作展開來克服。⑤當(dāng)被分離的物質(zhì)能溶于顯色劑中時(shí)，如顯色劑用量過多，可使斑點(diǎn)模糊或拖長。2023/2/4775.3.4操作確定并標(biāo)記點(diǎn)樣位置→點(diǎn)樣→濾紙飽和→展開→斑點(diǎn)檢出①點(diǎn)樣：距底邊15—20mm，點(diǎn)間距離約為8—12mm，樣點(diǎn)直徑為3mm左右。點(diǎn)好樣品，風(fēng)干或吹風(fēng)機(jī)吹干。②飽和與展開：將濾紙懸吊于裝有展開劑的色譜缸中，用蓋蓋好，靜置1—2h后將點(diǎn)樣端垂直浸入展開劑中展開。溶劑的前沿升到接近濾紙頂端時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆畫出溶劑前沿所在位置，吹干。2023/2/478紙色譜的上行展開法2023/2/479紙色譜的下行展開法2023/2/480③顯色：用噴壺距濾紙約30—40cm向?yàn)V紙均勻噴灑顯色劑，以濾紙基本打濕為宜。然后用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)緩緩吹干并加熱濾紙，直到顯示出紫色斑點(diǎn)為止。④測量Rf值與鑒定：用鉛筆將所有斑點(diǎn)的輪廓描出來，并確定出各斑點(diǎn)的重心位置，該點(diǎn)即為斑點(diǎn)位置。分別量出點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿的距離和各斑點(diǎn)位置的距離，按照Rf值定義計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值。2023/2/4815.4吸附柱色譜

柱色譜是將吸附劑填充到一根玻璃管或金屬管中進(jìn)行的色譜技術(shù)。這種方法可以用來分離大多數(shù)有機(jī)化合物，尤其適合于復(fù)雜的天然產(chǎn)物的分離。適用于分離和精制較大量的樣品。2023/2/4825.4.1吸附劑與洗脫劑根據(jù)待分離組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇合適的吸附劑和洗脫劑是分離成敗的關(guān)鍵。1吸附劑的要求①對樣品組分和洗脫劑都不會發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)，在洗脫劑中也不會溶解。②對待分離組分能夠進(jìn)行可逆的吸附，同時(shí)具有足夠的吸附力，使組分在固定相與流動相之間能最快地達(dá)到平衡。③顆粒形狀均勻，大小適當(dāng)，以保證洗脫劑能夠以一定的流速（一般為1.5mL·min-1）通過色譜柱。④材料易得，價(jià)格便宜而且是無色的，以便于觀察。2常用吸附劑的種類：氧化鋁、硅膠、聚酰胺、硅酸鎂、滑石粉、氧化鈣（鎂）、淀粉、纖維素、蔗糖和活性炭等。2023/2/4833幾種常見吸附劑的特性（1）氧化鋁：市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種類型，粒度規(guī)格大多為100～150目。堿性氧化鋁（pH9-10）：適用于堿性物質(zhì)（如胺、生物堿）和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等），也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內(nèi)酯的水解、醇羥基的脫水、乙酰糖的去乙?；⒕S生素A和K等的破壞等不良副反應(yīng)。所以，這些化合物不宜用堿性氧化鋁分離。酸性氧化鋁（pH3.5-4.5）：適用于酸性物質(zhì)如有機(jī)酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。中性氧化鋁（pH7-7.5）：適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來分離弱的有機(jī)酸和堿等。2023/2/484（2）硅膠：硅膠是硅酸的部分脫水后的產(chǎn)物，其成分是SiO2·xH2O，又叫縮水硅酸。柱色譜用硅膠一般不含粘合劑。適用范圍：非極性和極性化合物，適用于芳香油、萜類、甾體、生物堿、強(qiáng)心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成產(chǎn)品如有機(jī)金屬化合物等。（3）聚酰胺：色譜用聚酰胺主要有錦綸6（聚己內(nèi)酰胺）和錦綸66（聚己二酰己二胺）兩種，分子量一般在16000～20000，其親水性和親脂性均較好，因此既可分離水溶性成份，也可分離脂溶性成分?？扇苡跐恹}酸、甲酸及熱的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；對堿穩(wěn)定，對強(qiáng)酸可水解。聚酰胺色譜的原理：兼具吸附色譜和分配色譜的功能。采用強(qiáng)極性洗脫劑時(shí)主要為吸附色譜——正相色譜；采用弱極性洗脫劑時(shí)主要為分配色譜——反相色譜。2023/2/485分離對象：能與聚酰胺形成氫鍵的化合物，如酚類、酸類、醌類、硝基化合物及含羥基、氨基、亞氨基的化合物及腈和醛等類化合物。聚酰胺在水中吸附能力的規(guī)律：形成氫鍵的基團(tuán)(如：酚羥基、氨基、羧基、硝基等)越多，則吸附力越強(qiáng)。如：丁二酸＞丁酸2023/2/486形成氫鍵的位置與吸附力有很大關(guān)系。對位、間位酚羥基使吸附力增大，鄰位使吸附力減小。如：芳香核、共軛雙鍵多者吸附力大，少者吸附力小。如：2023/2/487若形成分了內(nèi)氫鍵，則使化合物的吸附力減小。如：（4）硅酸鎂：中性硅酸鎂的吸附特性介于氧化鋁和硅膠之間，主要用于分離甾體化合物和某些糖類衍生物。為了得到中性硅酸鎂，用前先用稀鹽酸，然后用醋酸洗滌，最后用甲醇和蒸餾水徹底洗滌至中性。2023/2/4884吸附劑的活度及其調(diào)節(jié)☆吸附劑的活性取決于它們含水量的多少，活性最強(qiáng)的吸附劑含有最少的水?！钗絼┑幕钚砸话惴譃槲寮墸謩e用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ表示。數(shù)字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ～Ⅲ?！钕蛭絼┲刑砑右欢ǖ乃梢越档推浠钚?。反之，如果用加熱處理的方法除去吸附劑中的部分水，則可以增加其活性，后者稱為吸附劑的活化。☆各種不同活度吸附劑的含水量見下表。2023/2/489表5－3各種不同活度的吸附劑的含水量2023/2/4905.4.2柱色譜實(shí)驗(yàn)操作（硅膠和氧化鋁柱色譜）吸附劑用量的確定→柱子的選擇→裝柱→柱留體積的測量→加樣或拌樣→洗脫→分步收集→檢測→合并→濃縮◆吸附劑的確定氧化鋁：一般選擇中性，粒度150～200目，超過220目需加壓；一般用量1g樣品/20～50g，特例1g樣品/100～200g硅膠：吸附色譜——1g樣品/20～50g，特例1g樣品/500～1000g，用前最好120烘24h，可不做活性測定。分配色譜——1g樣品/100～1000g，特例1g樣品/10000g。2023/2/491色譜柱的選擇：有玻璃柱和不銹鋼柱兩種，一般不使用有機(jī)玻璃柱，實(shí)驗(yàn)室常用玻璃柱；徑長比一般為1:10～1:20，特例1:40；內(nèi)壁光滑均勻，上下粗細(xì)一樣，管壁無裂縫，活塞密封良好；根據(jù)吸附劑用量（體積）確定柱子的大小，一般吸附劑應(yīng)填充到柱子體積的3/4～4/5左右。2023/2/492裝柱：有干裝法和濕裝法兩種。干裝法——在下端減壓抽氣的同時(shí)，將吸附劑通過長徑漏斗緩緩到入柱內(nèi)。濕裝法——①準(zhǔn)確加入一定體積的溶劑，然后緩慢加入吸附劑，必要時(shí)可輕敲柱壁，排除多余溶劑，計(jì)算主留體積；②準(zhǔn)確量取一定體積的溶劑倒入稱量好的吸附劑，間歇性攪拌數(shù)次，靜置過夜，次日在攪拌下裝柱，計(jì)算主留體積。2023/2/493加樣：①將樣品溶于合適的溶劑，在不擾動吸附劑層面的情況下，加到柱體上面。最后再用少量清潔溶劑對主壁洗滌2～3次；②將樣品溶于合適的溶劑后，在攪拌下加入樣品量3～5倍的吸附劑，晾干至粉末狀，然后在不擾動吸附劑層面的情況下，加到柱體上面。洗脫必須注意在洗脫的過程中，尤其是開始階段，不能擾動層面。洗脫速度一般為每分鐘流出1/200柱留體積左右。對于梯度洗脫需注意標(biāo)記不同溶劑的分界管號。2023/2/494分步收集：一般每管收集1/20～1/10柱留體積檢測：確定目標(biāo)物的位置及純化情況薄層色譜或紙色譜檢測；氣相色譜或液相色譜檢測；合并：成分相同或相似的收集液合并，交叉部分單獨(dú)收集。濃縮：旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)；確保燒瓶干燥干凈。柱色譜洗脫裝置2023/2/4955.4.3應(yīng)用舉例倍半萜烯物的分離餾分洗脫劑體積/ml含萃出物/g1石油醚200002石油醚20003.53石油醚-苯(1∶1)300016.44苯15009.55苯25005.46苯10008.07苯15008.58苯250010.89苯25003.510苯-5%乙醇200010.811苯-5%乙醇200077.312苯-5%乙醇100016.013苯-5%乙醇5004.514苯-5%乙醇15002.6第一步：25Kg含有倍半萜烯的植物組織經(jīng)磨碎，以石油醚萃取，得200g萃取物。分離用的柱子內(nèi)徑經(jīng)6cm，裝三氧化二鋁5.5Kg，含水6％。用洗脫能力遞增的溶劑進(jìn)行分步洗脫，萃出物被分成14個(gè)餾分。見右表2023/2/496第二步：用石油醚-乙醚（4∶1）硅膠薄層層析法對各餾分進(jìn)行分析，表明在餾分5～7和11～14中含有呋喃倍半萜烯化合物。第三步：25g餾分11用5Kg中性三氧化二鋁裝成的柱通過石油醚-乙醚（1∶1）再次進(jìn)行分離，每一餾分是10～15ml。這些餾分用硅膠G薄層層析，用石油醚-乙醚（6∶4）經(jīng)5次展開，適當(dāng)合并之后得到下列純物質(zhì)。結(jié)果：森林千里光素A：Rf=0.57，7.2g；

B：Rf=0.55，3.4g；

C：Rf=0.52，2.9g注：這種色譜（層）操作需要晝夜連續(xù)收集餾分持續(xù)一周時(shí)間2023/2/4975.4.4聚酰胺柱色譜聚酰胺（Polyamide）己發(fā)展成為分離極性和非極性物質(zhì)的用途廣泛的層析方法，如黃酮體、酚類、醚類、有機(jī)酸、生物堿、萜類、甾體、甙類、糖類、氨基酸衍生物、核苷類等。尤其是對黃酮體、酚類、醌類等物質(zhì)的分離，遠(yuǎn)比其他方法優(yōu)越。其特點(diǎn)是：對黃酮體等物質(zhì)的層析是可逆的，分離效果高，可使性質(zhì)極相近的類似物得到分離，其柱色譜的樣品容量大，適于制備分離。

2023/2/4981、聚酰胺色譜的溶劑系統(tǒng)：含水溶劑系統(tǒng)和非極性溶劑系統(tǒng)。含水溶劑系統(tǒng)：適用于各種甙類、糖類、有機(jī)酸等水溶性成分的分離，以及黃酮體甙與甙元、黃酮體與水溶性脂性成分等的分離。在含水溶劑系統(tǒng)中增加有機(jī)溶劑的比例，可使Ｒf值升高，洗脫能力增加。非極性溶劑系統(tǒng)：用于萜類、甾體、黃酮體甙元、酚類、醌類等極性不太高的化合物的分離。在該溶劑系統(tǒng)中增加極性溶劑的比例，可使Rf升高，洗脫能力增加。2023/2/4992、聚酰胺前處理和裝柱：若用含水溶劑系統(tǒng)色譜，常以水裝柱。聚酰胺粉以90%～95%乙醇浸泡（除去表面的蠟質(zhì)），不斷攪拌，除去氣泡后裝入層析柱中。用3～4倍體積的90%～95％乙醇洗滌，洗至洗液透明并在蒸干后無殘?jiān)ɑ驑O少殘?jiān)?。再依次?～2.5倍體積的5%

NaOH水溶液（除去單體和聚酰胺低聚物）、1倍體積的蒸餾水、2—2.5倍體積的l0％醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，備用。以非極性溶劑系統(tǒng)色譜時(shí)，常以溶劑組份中極性低的組份裝柱。若以氯仿裝柱，因其比重較大使聚酰胺粉浮在上面。加樣時(shí)應(yīng)將柱底端的氯仿層放出，并立即加樣，加樣后頂端以棉花塞緊。在層析關(guān)閉時(shí)，應(yīng)將頂端的多余氯仿液放出，否則，聚酰胺會浮起而攪亂層帶。

2023/2/4100加樣：樣品常用洗脫劑溶解，濃度在20%～30%。不溶樣品可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等易揮發(fā)溶劑溶解。拌入干粉中，拌勻后將溶劑減壓蒸去，以洗脫劑浸泡裝入柱中。一般每l00ml聚酰胺粉可上樣1.5—2.5克?？筛鶕?jù)具體情況適當(dāng)增加或減少。若利用聚酰胺除去鞣質(zhì)，樣品上樣量可大大增加。通常觀察鞣質(zhì)在柱上形成橙紅色色帶的移動，當(dāng)樣品加至該色帶移至柱的近底端時(shí)，停止加樣。2023/2/4101洗脫：聚酰胺色譜的洗脫劑常采用由稀至濃的乙醇液（10%、30%、50％、70％、95%），或氯仿→氯仿-甲醇（19+1，l0+1，5+1，2+1，1+1）→甲醇依次洗脫。若仍有物質(zhì)末洗脫下來，可采用3.5%氨水洗脫。洗脫劑的更換一般在洗脫液的顏色變?yōu)楹艿瓡r(shí)進(jìn)行。收集與檢測：2023/2/4102聚酰胺粉的再生：一般用5%NaOH洗滌，洗至氫氧化鈉顏色極淡為止。有時(shí)因某些鞣質(zhì)與聚酰胺有不可逆吸附，用氫氧化鈉很難洗脫時(shí)，可用5%NaOH液在柱中浸泡。每天將柱中之氫氧化鈉液放出一次，并加入新的氫氧化鈉液浸泡，這樣浸泡洗滌一周后，鞣質(zhì)可基本洗完。然后用蒸餾水洗至pH8～9，再以2倍量10%

醋酸洗，最后以蒸餾水洗至中性，供重復(fù)使用。

2023/2/41035.4.5活性炭柱色譜活性炭柱層析對于分離水溶性物質(zhì)（如氨基酸、糖類及某些甙類）是一種較好的方法，它是分離水溶性物質(zhì)的主要方法之一。其特點(diǎn)是樣品上柱量大，分離效果好，活性炭來源較易，價(jià)格便宜，適用于大量制備分離。

2023/2/41041、層析用活性炭的類型：三類（1）粉末狀活性炭：一般采用醫(yī)藥用或化學(xué)純活性炭。該類活性炭顆粒極細(xì)，呈粉末狀，其總表面積特別大，吸附力及吸附量也特別大，是活性炭中吸附力最強(qiáng)的一類。缺點(diǎn)是顆粒太細(xì)，流速極慢，需要加壓或減壓操作，手續(xù)較繁。（2）顆粒狀活性炭：其顆粒較前者為大，其總表面積也相應(yīng)減小，吸附力及吸附量比較次于前者。在層析過程小流速易于控制，勿需加壓或減壓操作，克服了粉末狀活性炭的缺點(diǎn)。（3）錦綸—活性炭：這種活性炭是以錦綸為粘合劑，將粉末狀活性炭制成顆粒。其總表面積大于顆粒狀活性炭，小于粉末狀活性炭，其吸附力較二者皆弱。錦綸起粘合活性炭和降低活性炭活性的作用，因此可用于分離前兩種活性炭吸附太強(qiáng)而不易洗脫的化合物。用其分離酸性氨基酸及堿性氨基酸，可取得很好效果。流速易控制，操作簡便。目前該種活性炭尚無工廠生產(chǎn)，由實(shí)驗(yàn)室制備。

2023/2/41052、活性炭的選擇原則根據(jù)所分離物質(zhì)的特性，選擇適當(dāng)吸附力的活性炭乃是分離成功的關(guān)鍵。一般首先選用第二類活性炭。當(dāng)發(fā)現(xiàn)吸附較小，則改用第一類活性炭。當(dāng)發(fā)現(xiàn)活性較強(qiáng)，則改用第三類活性炭。有時(shí)可將三類活性炭聯(lián)合應(yīng)用，適用于較復(fù)雜的成分分離。一般首先通過第三類活性炭，對活性炭附著力最強(qiáng)的物質(zhì)吸在該柱上。未被吸附物再通過第二類活性炭柱，附