分子生物學(xué)第10章基因文庫(kù)和目的基因的分離

10.1基因文庫(kù)的構(gòu)建10.2克隆已知基因產(chǎn)物或核苷酸序列信息的基因10.3蛋白質(zhì)功能互補(bǔ)克隆10.4定位克隆10.5差示減法雜交法系列10.6通過DNA全序列分析確定基因10基因文庫(kù)和目的基因的分離建立基因文庫(kù)的意義

為了深入揭示生命活動(dòng)的奧秘，必須研究基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)、調(diào)控。而要對(duì)某個(gè)特定基因進(jìn)行研究，又必須把這個(gè)基因分離出來。為了在龐大的基因組中準(zhǔn)確地找出特定的基因，首先需要建立基因文庫(kù)。

基因文庫(kù)的概念

基因文庫(kù)分為基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)兩種?；蚪M文庫(kù)是將來自一個(gè)有機(jī)體的不同隨機(jī)DNA序列片段與載體重組，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，得到該物種基因組的一群重組體克隆。這些克隆的集合體即為基因組文庫(kù)，其中包含了該有機(jī)體基因組的全部序列。在這些克隆中，有序列重復(fù)和序列重疊。cDNA文庫(kù)是提取某一生物材料（組織、細(xì)胞）的總mRNAs，反轉(zhuǎn)錄成cDNAs，再與載體重組，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，得到克隆的集合體。（注意沒有酶切步驟，與載體連接時(shí)的末端處理除外）基因文庫(kù)的作用是從中篩選目的基因或特定序列。圖10－1基因文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的內(nèi)容

基因組文庫(kù)包括了基因上游調(diào)控序列、內(nèi)含子、外顯子、下游序列等，如果為了研究基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控，應(yīng)建立基因組文庫(kù)；基因組文庫(kù)還可以用于研究不同基因在染色體上的排列情況?；蚪M文庫(kù)實(shí)際上是DNA文庫(kù)，它是以DNA片段為克隆對(duì)象，而不是以基因?yàn)榭寺?duì)象。

基因組文庫(kù)的大小

在建立高等真核生物的大型基因組DNA文庫(kù)時(shí)，需要克隆大量的不同DNA片段，才能以一種合理的概率獲得含有目的基因的克隆。以人β－珠蛋白基因?yàn)槔?，其大小約為1.5kb，而人的單倍體基因組總長(zhǎng)度為3×106kb左右，若按片段的平均長(zhǎng)度為1.5kb計(jì)算，理論克隆數(shù)為2百萬（3×106/1.5）?；蚪M文庫(kù)的大小

由于DNA片段是隨機(jī)克隆的，這個(gè)理論克隆數(shù)只是基因組文庫(kù)所需要的最小值。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上講，這意味著一個(gè)只有理論克隆數(shù)的基因組文庫(kù)中含有一種特定的單拷貝基因的概率只有50%。而當(dāng)基因組文庫(kù)的克隆數(shù)為2倍理論克隆數(shù)時(shí)，這個(gè)概率提高到75%。因此，為了能夠以一種合理的概率篩選出單拷貝的目的基因，一個(gè)完全的基因組文庫(kù)就必須含有3～10倍于理論克隆數(shù)的克隆。實(shí)際克隆數(shù)的計(jì)算公式

1975年L.Clarke和J.Carbon提出了一個(gè)計(jì)算一個(gè)完全基因組文庫(kù)所需實(shí)際克隆數(shù)的公式：

式中N為所需要的實(shí)際克隆數(shù)；p為在基因組文庫(kù)中出現(xiàn)目的基因的概率（一般要求99%）；f=DNA片段平均長(zhǎng)度/基因組DNA總長(zhǎng)。實(shí)際克隆數(shù)的計(jì)算

以單倍體基因組總長(zhǎng)度為3×106kb左右為例，片段平均長(zhǎng)度為1.5kb時(shí)，而片段平均長(zhǎng)度為2kb時(shí)，

從式中可以看出，DNA片段平均長(zhǎng)度越長(zhǎng)，N值越小，所以在建立基因組文庫(kù)時(shí)，應(yīng)選用大容量的載體，以減少克隆數(shù)。DNA片段的制備

純化的基因組DNA必須切割成適當(dāng)大小的片段才能與載體重組，因?yàn)槿魏我环N載體都有容量限制。選用不同的載體就要將DNA切割成相應(yīng)大小的片段。DNA片段越大，包含基因組DNA全部序列的克隆數(shù)就越少。所以應(yīng)選用容量大的載體。DNA片段的制備

首先要提取和純化核基因組DNA（根據(jù)研究目的，還可以是細(xì)胞器基因組DNA），在提取和純化時(shí)，盡量不要讓DNA斷裂成太小的片段。若用限制性內(nèi)切酶部分消化來獲得適合某種載體攜帶的DNA片段，則DNA的初始長(zhǎng)度應(yīng)至少是用于克隆的片段的4倍，否則生成的有效片段相對(duì)較少（一端為酶切出的粘性末端，另一端為機(jī)械力造成的平端為無效片段）。DNA片段的制備

用粘粒構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)，初始DNA的長(zhǎng)度應(yīng)大于200kb；若以取代型λ噬菌體載體構(gòu)建文庫(kù)，初始DNA應(yīng)大于100kb。控制限制性內(nèi)切酶的加入量及消化的時(shí)間，可使酶切片段成為適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，對(duì)粘粒載體要求45kb左右，對(duì)取代型λ噬菌體載體要求20kb左右。DNA片段的制備

物理剪切產(chǎn)生適合克隆的DNA片段的方法有抽吸、高速攪拌和超聲波處理等。物理剪切的隨機(jī)性比限制酶部分消化要好，但物理剪切產(chǎn)生的片段與載體連接較困難。DNA片段的制備結(jié)果圖多個(gè)相同的DNA分子切割重復(fù)和重疊的片段

限制性內(nèi)切酶消化或物理剪切后有些太長(zhǎng)或太短的片段不適合克隆，應(yīng)通過瓊脂糖凝膠電泳或蔗糖密度梯度離心，分離出大小適合克隆的片段，與載體重組后轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌。cDNA文庫(kù)的用途

cDNA文庫(kù)含有各種mRNA的序列，含有翻譯調(diào)控序列和蛋白質(zhì)的編碼序列。為了研究基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)的氨基酸序列，應(yīng)建立cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的類型

cDNA文庫(kù)一般分為表達(dá)型文庫(kù)和非表達(dá)型文庫(kù)，對(duì)于用抗體篩選或生物活性篩選，應(yīng)采用表達(dá)型文庫(kù)，表達(dá)型文庫(kù)用表達(dá)型載體構(gòu)建，即在外源DNA插入位點(diǎn)的5’上游有強(qiáng)啟動(dòng)子，如λgt11、λZAP等；而非表達(dá)型文庫(kù)只能用DNA探針篩選，用非表達(dá)型載體構(gòu)建，如λgt10，探針可根據(jù)已知氨基酸序列反推核苷酸序列人工合成，也可根據(jù)其他親源關(guān)系相近物種的同源序列合成。cDNA文庫(kù)的大小

對(duì)于高豐度的mRNA，可構(gòu)建相對(duì)較小的cDNA文庫(kù)；而對(duì)于低豐度的mRNA，就應(yīng)構(gòu)建較大的cDNA文庫(kù)；對(duì)于極低豐度的mRNA，應(yīng)先進(jìn)行富集，如按mRNA大小分級(jí)、按cDNA大小分級(jí)、免疫沉淀多聚核糖體等，這樣能大大減少cDNA文庫(kù)的克隆數(shù)。文庫(kù)的大小由用來反轉(zhuǎn)錄的mRNA的量決定。cDNA文庫(kù)的制備提取和純化總mRNA以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板，合成cDNA第二鏈雙鏈cDNA與載體連接重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞培養(yǎng)、選擇陽性克隆mRNA的提取

盡量選擇目的mRNA豐度高的組織和時(shí)期提取mRNA。提取mRNA的一般方法是先提取總RNA。在液氮中研磨植物材料，然后加入提取液提取；對(duì)于動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞一般采用SDS和蛋白酶K裂解細(xì)胞后提取，而動(dòng)物組織采用研磨提取。再經(jīng)過各種萃取、沉淀步驟純化總RNA。

在RNA提取純化過程中，特別要注意避免RNase的破壞作用。

mRNA的提取

從總RNA中分離mRNA采用oligo(dT)12-18-cellulose柱層析法，上樣后先用上樣緩沖液（含有0.5mol/LNaCl）洗至OD260接近或等于0，再換用不含NaCl的洗脫緩沖液將結(jié)合在柱上的mRNA洗脫下來，洗脫的產(chǎn)物中一般有一半帶有poly（A）尾。為了進(jìn)一步純化mRNA，可將產(chǎn)物再進(jìn)行一次柱層析。圖10－3cDNA第一鏈的合成圖10－4自身引導(dǎo)法合成cDNA第二鏈圖10－5RNaseH法合成cDNA第二鏈圖10－6PCR法擴(kuò)增cDNA雙鏈cDNA與載體的連接1.同聚物加尾連接：為了使克隆效率達(dá)到最佳，質(zhì)粒和cDNA上的同聚物殘基數(shù)應(yīng)當(dāng)接近相等，同聚物為dA和dT時(shí)應(yīng)為100個(gè)左右，為dC和dG時(shí)應(yīng)為20個(gè)左右。此法不能用于λ噬菌體載體。用質(zhì)粒載體構(gòu)建的文庫(kù)要比用λ噬菌體載體構(gòu)建的文庫(kù)更難以貯存和復(fù)制。cDNA與載體的連接2.加連接子連接：給已成平端的cDNA兩端接上連接子，再用限制酶切連接子產(chǎn)生粘性末端與載體連接。由于在cDNA中也可能有此限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，酶切時(shí)可能會(huì)將cDNA切成兩段或更多段。要解決這個(gè)問題，可在加連接子之前先用識(shí)別該位點(diǎn)的甲基化酶對(duì)cDNA中可能存在的限制酶切位點(diǎn)甲基化，將這些位點(diǎn)保護(hù)起來，然后再加連接子連接。cDNA與載體的連接3.加適配子連接：由于適配子本身就帶有粘性末端，不需要再用限制酶切割，因此不會(huì)造成cDNA被切斷的情況。但在用限制酶取出外源DNA時(shí)有可能被切斷。cDNA的正確表達(dá)

對(duì)于建立表達(dá)型cDNA文庫(kù)來說，cDNA插入的方向和閱讀框的正確非常重要，若按一般方法插入，只有1/6的重組DNA能表達(dá)出正確的蛋白產(chǎn)物。若給cDNA兩端接上不同的連接子，載體也用相應(yīng)的兩種限制酶切，則可以以正確方向插入，能表達(dá)出正確蛋白產(chǎn)物的比例提高到了1/3。為了提高正確表達(dá)率，還可以采用三種不同長(zhǎng)度(相差一個(gè)核苷酸)的連接子或適配子，以保證插入片段有一個(gè)正確的閱讀框。使用λ噬菌體載體制作文庫(kù)

用λ噬菌體載體時(shí)，載體應(yīng)過量，并事先除去5＇端磷酸以防止載體自身連接。經(jīng)大腸桿菌DNA連接酶或T4DNA連接酶連接后，用λ噬菌體包裝蛋白體外包裝成有感染力的噬菌體顆粒，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主大腸桿菌中。λ重組載體的包裝方法

包裝的方法有兩種：一種是用兩種溶源菌的提取物混合包裝。BHB2690菌株中的原噬菌體有D基因突變，不能產(chǎn)生D蛋白。D蛋白位于頭部的外面，參與λ噬菌體DNA進(jìn)入前頭部和頭部的成熟這兩個(gè)連續(xù)過程。D基因突變可以積累前頭部，但不能使DNA插入頭部，所以不能裂解宿主菌。BHB2688菌株的原噬菌體有E基因突變，E蛋白是頭部的主要組成成份，E基因突變不能形成前頭部，可以積累大量的各種其它蛋白，也不能裂解宿主菌。

λ重組載體的包裝方法

先在32℃培養(yǎng)溶源菌至對(duì)數(shù)中期，將培養(yǎng)溫度提高到45℃保溫15分鐘，以滅活cⅠ阻遏物并誘導(dǎo)裂解功能，再將細(xì)菌于38～39℃培養(yǎng)2～3小時(shí)，使包裝蛋白逐漸積累，然后制備細(xì)菌提取物。用超聲波破碎菌體后離心得到上清液即為提取液，這兩種細(xì)胞提取液和重組λ噬菌體DNA混合后可自動(dòng)包裝成有感染力的噬菌體顆粒。λ重組載體的包裝方法

另一種方法是用一種溶源菌提取物包裝。SMR10菌株中的原噬菌體編碼有包裝所需的全部蛋白，但其cos位點(diǎn)缺失，誘導(dǎo)后產(chǎn)生的噬菌體DNA不能進(jìn)入前頭部。包裝后轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率為108pfu/μg（pfu，plaqueformingunit，噬菌斑形成單位），要比用重組λDNA直接轉(zhuǎn)染大腸桿菌高得多。目的基因的克隆用目的基因的雜交探針原位雜交，從基因文庫(kù)中分離目的基因探針的制備：①人工合成的寡核苷酸：已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，反推出其基因的核苷酸序列，合成簡(jiǎn)并探針。盡量避免多密碼子的氨基酸區(qū)段。②同源探針：利用目的基因在另一物種相應(yīng)基因中的同源保守序列作探針。表達(dá)融合蛋白和獨(dú)立的外源蛋白

在λZAP中，多克隆位點(diǎn)位于lacZ‘基因之前，合成出來的融合蛋白的氨基端為外源蛋白，羧基端為半乳糖苷酶的146個(gè)氨基酸。也有一些表達(dá)載體可以表達(dá)出獨(dú)立完整的外源蛋白，如pKC30和pKK177-3，它們不產(chǎn)生融合蛋白，前者利用λ噬菌體的PL啟動(dòng)子，熱激誘導(dǎo)表達(dá)；后者利用tac啟動(dòng)子，它是一個(gè)trp-lac雜合啟動(dòng)子，由lac阻遏物所調(diào)控，受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。目的基因的克隆2用抗體篩選表達(dá)文庫(kù)

若使用表達(dá)載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)，可以表達(dá)出各cDNA編碼的蛋白質(zhì)，這種cDNA文庫(kù)叫表達(dá)文庫(kù)。將表達(dá)文庫(kù)的平板轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，裂解細(xì)胞后酶聯(lián)免疫檢測(cè)或125I標(biāo)記抗體放射自顯影檢測(cè)?？梢詮谋磉_(dá)文庫(kù)中篩選出陽性克隆。此法要求宿主菌本身不合成該蛋白。

基因組文庫(kù)不能是表達(dá)文庫(kù)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)

將菌落轉(zhuǎn)印到NC膜上，用氯仿蒸氣處理膜，使細(xì)菌在膜上裂解，或45℃高溫誘導(dǎo)溶源菌裂解。然后加一抗結(jié)合，酶標(biāo)二抗結(jié)合，加底物顯色。雙位點(diǎn)檢測(cè)法

雙位點(diǎn)檢測(cè)法特別適合于檢測(cè)融合蛋白：可把抗A-B融合蛋白A部分的抗體固定在固體基質(zhì)上，最簡(jiǎn)單的方法是將抗A抗體直接涂抹在聚乙烯平皿上，然后將已裂解的轉(zhuǎn)化菌轉(zhuǎn)印到此平皿上，這時(shí)A-B蛋白通過A部分與平皿上的抗A抗體結(jié)合。再加放射性125I標(biāo)記的抗B抗體，這些抗體結(jié)合到A-B蛋白的B部分。最后放射自顯影，從原菌落復(fù)制平板上挑選陽性克隆。目的基因的克隆3用識(shí)別位點(diǎn)探針篩選表達(dá)文庫(kù)

特定序列的雙鏈DNA經(jīng)標(biāo)記后，可用于篩選能與該序列特異結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白。如用啟動(dòng)子上的順式元件篩選與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。目的基因的克隆4蛋白質(zhì)功能互補(bǔ)尋找目的基因

用突變體宿主菌，此宿主菌因某基因突變，帶有容易檢測(cè)出的缺陷表型，若用攜帶外源該正常基因的表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化，可使宿主菌的缺陷表型得到糾正，即為蛋白質(zhì)功能互補(bǔ)。其理論基礎(chǔ)是有些基因產(chǎn)物在不同的生物種中能發(fā)揮同樣的功能。常用的宿主菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌。圖10－8經(jīng)酵母功能互補(bǔ)分離血紅素生物合成的鐵螯合酶基因(1)圖10－8經(jīng)酵母功能互補(bǔ)分離血紅素生物合成的鐵螯合酶基因(2)定位克隆

如果不知道某個(gè)基因的核苷酸序列和其表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列，也沒有其表達(dá)產(chǎn)物的抗體，只知道它造成的表型特點(diǎn)，就可以采用定位克隆的方法來尋找該基因。定位克隆可以搞清楚基因在染色體上的位置及相鄰基因的位置關(guān)系，也可以找到被不同克隆分割開的一個(gè)完整的大基因。

酵母人工染色體

為了減少染色體步查時(shí)的工作量，要求基因組文庫(kù)的克隆數(shù)少為好，因此要求每一個(gè)克隆的外源DNA片段要大。酵母人工染色體（Yeastartificialchromosome,YAC）也是一種DNA載體，與外源DNA重組后轉(zhuǎn)化酵母菌，在宿主菌內(nèi)的表現(xiàn)和染色體一樣，可以復(fù)制和分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。YAC可以克隆很大的DNA片段（200～500kb）。pYAC4的特點(diǎn)①一對(duì)來自四膜蟲染色體的端粒(TEL)②一段來自酵母染色體的著絲粒序列(CEN4)③一段控制酵母染色體復(fù)制的自主復(fù)制序列(ARS1)④在酵母菌中的選擇標(biāo)記(左臂TRP1和右臂URA3，可與營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌互補(bǔ)而篩選)⑤在大腸桿菌中的復(fù)制起點(diǎn)(Ori)⑥在大腸桿菌中的選擇標(biāo)記(ampr)⑦插入失活標(biāo)記(SUP4)⑧一些限制酶切位點(diǎn)，其中位于SUP4中有一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)用于插入外源DNA。YAC文庫(kù)構(gòu)建的基本步驟基因組DNAYAC文庫(kù)構(gòu)建的基本步驟YAC文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

pYAC4在大腸桿菌中擴(kuò)增，提取出來后用BamH1及EcoRⅠ切割，分離純化兩臂，除去兩BamH1位點(diǎn)間的短片段。用小牛腸堿性磷酸酶CIP處理脫去兩臂的5＇磷酸以避免載體自身連接。加入用EcoRⅠ部分消化并經(jīng)脈沖電泳分級(jí)的基因組DNA片段（contigs，重疊群），連接酶連接，轉(zhuǎn)化受體酵母菌，在選擇培養(yǎng)基中選擇陽性克?。t色菌落）。YAC文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

選擇培養(yǎng)基缺色氨酸和尿嘧啶，被YAC轉(zhuǎn)化了的酵母菌能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。選用的受體菌帶有ade2赭石突變基因，ade2編碼有關(guān)腺嘌呤合成的一個(gè)必需酶（磷酸核糖氨基咪唑羧化酶），該酶突變后腺嘌呤不能合成，從而積累腺嘌呤的前體磷酸核糖氨基咪唑（粉紅色），使菌落成粉紅色。YAC載體中帶有SUP4，這是tRNATyr赭石校正基因，載體轉(zhuǎn)化受體菌后，代謝正常，形成白色菌落。若有外源DNA插入SUP4中，不能校正赭石突變，形成紅色菌落。三種終止密碼子的別名UAAochre赭石密碼UAGamber琥珀密碼UGAopal蛋白石密碼染色體步查的基本原理和步驟

根據(jù)遺傳圖譜，選擇與目的基因連鎖并相距最近的分子標(biāo)記開始，此標(biāo)記稱為旁側(cè)標(biāo)記（flankingmarkers），常用的分子標(biāo)記是RFLP和RAPD。一旦鑒別出了最緊密連鎖的旁側(cè)標(biāo)記后，步查就可以開始了。這包括分離在一系列連續(xù)的交疊克?。╝contig）中旁側(cè)標(biāo)記之間的DNA。染色體步查的基本原理和步驟

第一步是用旁側(cè)標(biāo)記的探針篩選基因組文庫(kù)。制備探針的方法依賴所用旁側(cè)標(biāo)記的性質(zhì)，如果旁側(cè)標(biāo)記是常規(guī)的RFLPs，則用來檢測(cè)RFLPs的探針可以直接用于篩選文庫(kù)；如果用的是基于PCR的標(biāo)記，制備探針的方法依賴所用標(biāo)記的類型和被篩選的文庫(kù)類型。對(duì)于涉及到許多不連鎖DNA片段擴(kuò)增的標(biāo)記，應(yīng)該只用相應(yīng)的連鎖片段作探針。對(duì)于只擴(kuò)增單個(gè)特定DNA片段的方法，如切割擴(kuò)增多態(tài)性序列（cleavedamplifiedpolymerphicsequence,CAPS）標(biāo)記，可以直接將引物用于基于網(wǎng)格狀YAC文庫(kù)的篩選。

染色體步查的基本原理和步驟

用每一個(gè)旁側(cè)探針第一次篩選通常產(chǎn)生一組（cluster）YACs。如果兩個(gè)旁側(cè)探針相距很近，且YAC文庫(kù)的插入片段很大，兩個(gè)探針可以雜交到同一個(gè)YAC上，說明這個(gè)YAC包括了目標(biāo)基因。如果兩個(gè)YAC組不相連，就需要繼續(xù)步查。用探測(cè)到的YAC的外源DNA片段的兩端制作的探針可以作出更詳細(xì)的圖譜，這將確定YACs的末端關(guān)于同組其它YACs的圖譜定位。

染色體步查的基本原理和步驟

除了兩個(gè)末端外，所有末端都應(yīng)該至少雜交到另一個(gè)YAC上，這兩個(gè)末端代表了這組YACs的最近端和最遠(yuǎn)端（極末端）。以此極末端序列為探針，從分離群體中測(cè)定這兩個(gè)探針序列與目的基因的遺傳距離（交換率），選擇與目的基因距離較近的那個(gè)極末端探針，再開始第二步探測(cè)。重復(fù)這些步驟，直到探針序列與目的基因的遺傳距離為0或又變大為止。

染色體步查的基本原理和步驟

從第二步開始，也可以通過作限制酶切圖譜與前一片段比較來找出步查的方向。最后將目的基因定位到一個(gè)DNA片段上。必須注意的是，探針序列不能是重復(fù)序列。染色體步查的基本原理和步驟

由于YAC攜帶的外源DNA片段很大，尋找到含有目的基因的DNA片段后可以將其切割成更短的片段，用粘粒載體亞克隆后繼續(xù)細(xì)找。并通過功能互補(bǔ)法（或功能測(cè)定）找出確定的片段。

對(duì)于已建立了高密度遺傳標(biāo)記的植物來說（如擬南芥菜），只需一兩步即能找到目標(biāo)片段。當(dāng)相關(guān)物種間有同線性存在時(shí)，一個(gè)物種中的標(biāo)記也可用于另一個(gè)物種。目的基因的克?、?/p>

5定位克隆—染色體步查法轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法的基本原理

首先將一對(duì)親本雜交，親本之一應(yīng)含有活性的轉(zhuǎn)座子（自主轉(zhuǎn)座子），然后對(duì)子代中目的性狀發(fā)生的突變進(jìn)行篩選，選擇比自發(fā)突變頻率高10-4～10-3范圍內(nèi)的突變，這種突變很可能是由于轉(zhuǎn)座子插入了控制突變表型的基因造成的。用突變個(gè)體構(gòu)建基因組