薄層色譜法概述課件

第四章薄層色譜法2/5/20231概述1938年俄國人首先實現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。1965年德國化學家出版了“薄層色譜法”一書，推動了這一技術的發(fā)展。因TLC法設備簡單，分析速度快，分離效率高，結果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期發(fā)展了高效薄層色譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密度掃描儀，和各步操作的儀器化，并實現(xiàn)了計算機化。2/5/20232薄層色譜與高效液相色譜的差別（特點）固定相和流動相TLC——流動相流動靠毛細作用力，流動相選擇較少受限制，固定相不用再生。而HPLC是在封閉的系統(tǒng)內(nèi)，流動相流量靠泵控制，溶劑選擇受檢測器限制，固定相需再生。樣品處理TLC要求沒有HPLC嚴格。2/5/20233色譜分離TLC可同時分離多個樣品，并可采用相同或不同溶劑進行同向或雙相多次展開，通常采用正相色譜，色譜后衍生化方便。HPLC一次只能分離一個樣品，通常采用反相色譜，色譜后衍生化受限制。對污染物抗受力強TLC——顆粒物質、腐蝕性物質、不可逆吸附物質均無影響。HPLC——顆粒物質、腐蝕性物質、不可逆吸附物質均有大的影響。2/5/20234薄層色譜系統(tǒng)薄層板未改性固定相硅膠—為使用最廣泛的薄層材料氧化鋁—有堿性、中性、酸性硅藻土—為化學中性吸附劑纖維素—天然多糖類聚酰胺—為特殊類型有機薄層材料，對能形成氫鍵的物質有特別的選擇性。2/5/20235表面改性固定相疏水改性硅膠——化學鍵合烷基親水改性硅膠——引入氨基、氰基、二羥基等，薄層板極性介于極性吸附劑和疏水改性劑之間（極性次序：硅膠﹥氨基﹥氰基﹥二羥基﹥反相）。表面改性纖維素——乙?；w維素藥典收載的固定相有：硅膠類、硅藻土類、氧化鋁類、微晶纖維素類等。顆粒直徑一般要求10–40um。2/5/20236載板——玻璃板，放在飽和碳酸鈉溶液中浸泡數(shù)小時，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干凈，干燥，置干燥器中備用。要求光滑、平整、洗凈后不附水珠。黏結劑無機黏結劑——石膏（硫酸鈣），添加石膏的吸附劑以字母“G”表示。沒有黏結劑的吸附劑以字母“H”表示。無機黏結劑的優(yōu)點是：耐高溫，耐酸堿，但涂鋪薄板動作要快，否則勻漿易凝固。薄層強度差。2/5/20237有機黏結劑——羧甲基纖維素鈉（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特點是薄層強度高、使用方便，但不能用濃硫酸作顯色劑。熒光黏結劑——在吸附劑中添加某種熒光指示劑，常用的熒光指示劑在254nm紫外光下發(fā)藍色熒光的有鈉熒光素、硫化鎘、陰極綠等。在366nm有熒光的指示劑如彩藍等。含有熒光指示劑的商品吸附劑以“F”表示，并以下標注明其激發(fā)光波長。例硅膠HF254

2/5/20238薄層板涂鋪要求：均勻、平整、無氣泡引起的凹坑和龜裂。例：硅膠板（粒度10～40um）硅膠G——將硅膠置研缽中，加入少量水，研磨均勻，至無結塊和氣泡，再加入比例量的水(一般為1份固定相與3份水)，迅速研磨均勻，立即涂鋪。硅膠或硅膠G——以CMC為黏合劑。配制0.2%～0.7%CMC水溶液,放置過夜,使懸浮的纖維沉降,取上層用來配制吸附劑勻漿。2/5/20239反相薄層板制備——以不同鏈長的正構烷烴為固定液,配制成適當濃度的溶液(如5%硅酮油乙醚溶液),浸漬硅膠板。薄層板活化涂布后的薄層先在室溫下陰干，在使用前置適當溫度烘烤一定時間進行活化，然后置干燥器中備用。不同薄層活化條件略有不同，如：硅膠110℃1h氧化鋁110℃30min2/5/202310點樣要求配制樣品的溶劑高度揮發(fā)性和盡可能非極性，否則易使斑點擴展。采用多次點加法，第二次點加時應待前一次點加的溶劑揮發(fā)后再進行。點樣量應適中，過載會引起斑點拖尾，分離度變差，以最小檢測量的幾倍～幾十倍為宜。手工點樣工具：定容玻璃毛細管（1–5ul），微量注射器。2/5/202311自動點樣LimomatIV噴樣儀——樣品溶液通過氣流成霧狀噴向薄層，移動板臺，使在薄層上流下樣品條帶。特點：適合于大量稀樣品溶液的噴加；條帶寬度不超過2mm，有利于改善分辨率；便于狹縫式光密度計掃描；要求薄層板強度高。自動薄層色譜點樣儀——由計算機控制。藥典規(guī)定：點樣基線距底邊2.0cm,樣點直徑2-4mm,點間距離約為1.5-2.0cm。2/5/202312展開方式多數(shù)采用直線形上行展開，薄層板水平角度以75為最佳。展開距離一般為10-15cm。多次展開——一次展開未達滿意分離時，可將薄層板干燥后再次用同一種溶劑展開，可重復多次，直到混合物分離為止。分步展開——混合物性質差別較大時，一種流動相不能有效分離時，可采用不同溶劑依次展開不同距離。2/5/202313連續(xù)展開——使到達薄層上緣的溶劑不斷蒸發(fā)，連續(xù)展開以增加展開距離。因無溶劑前沿，需要有個參照物同時展開，以計算相對保留值。二維展開——在兩個垂直的方向上進行展開。將樣品點在薄層板的一個角上，展開適當距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90的方向進行展開。原點122/5/202314離心展開——薄層板以適當轉速旋轉時，流動相以適當速率轉移到薄層上。該技術主要用于制備色譜。鍥尖技術——圓形離心展開具有分辨率高的優(yōu)點，但需要有一定的儀器裝置。采用鍥尖技術可以在一般的展開室中進行類似展開。薄層被刮掉部分溶劑前沿2/5/202315檢測物理方法——紫外光下顯示熒光或熒光淬滅化學方法——加化學試劑顯色，要求顯色穩(wěn)定、持久、專屬、靈敏、線性良好。斑點定位方法碘蒸氣法——靈敏、簡便，為通用顯色法。將碘結晶放在密封的展開缸中，碘的升華，使缸內(nèi)充滿紫色的碘蒸氣。將展開后的板揮干溶劑置碘缸中至薄層色譜上出現(xiàn)棕色斑點。放置時間不宜太長，否則背景吸附劑也吸附碘，使信噪比降低。用針頭將斑點標記下來，放在通風處使碘揮發(fā)。2/5/202316薄層色譜參數(shù)保留參數(shù)（Rf值）用來表征斑點位置的基本參數(shù)是保留因子，通常稱作比移值，用Rf表示。Rf=Ls/L。，原點SRWLsL。Lr原點參比樣品前沿2/5/202317注意：同一物質在不同展開方式中得到的比移值是不相同的。在同樣溶劑的重復n次的多次展開后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n。相對比移值（Rx）Rf測量中一個重要的誤差來源是難以確定溶劑前沿的位置，因此，引入相對比移值（Rx）。

Rx=Ls/Lr2/5/202318分離效能參數(shù)理論塔片數(shù)n=16[Ls/W]2，考慮靜態(tài)擴散引起的起始斑點半峰寬的影響引入真實塔片數(shù)（n真實）n真實=5.54[Ls/（b0.5-b0）]2b0.5為樣品斑點半峰寬，b0樣品起始斑點半峰寬。塔片高度h真實=Ls/n真實

2/5/202319容量因子（k）與比移值（Rf）k=ts/tm（物質在兩相中滯留時間之比）又k=K（Vs/Vm）Rf=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k）k∞94210.50Rf00.10.20.330.50.6712/5/202320分離參數(shù)R=因Ls=RfL。，同時對相鄰的兩個斑點，假定W1=W2=W則R=L。=×⊿Rf與n=16[Ls/W]2式合并，得：2(Ls2-Ls1)W1+W2Rf2-Rf1WL。W2/5/202321R=由上式，Rf與R之間存在著如圖所示關系×

4⊿RfRf10.10.30.50.70.9Rf1R1.000.750.50.250Rf=0.3,R最高Rf在0.2-0.5,R變化不大Rf﹤0.1或﹥0.7,R下降

2/5/202322流動相與展開體系液-固吸附——在該色譜中，溶質的保留和分離選擇性決定于三個因素：溶解能力流動相溶質吸附劑相互作用競爭2/5/202323液-液分配基于組分在互不相溶的兩相間的溶解度不同而實現(xiàn)分離的一種展開系統(tǒng)?？稍谡归_前，將薄層板浸入某種液體固定相。實際上在TLC中，分配與吸附是并存的（大氣中水分也是一種固定相）。此外還有：化學鍵合相反相展開、化學鍵合相正相展開、離子交換、離子對色譜、凝膠、膠束、手性展開。2/5/202324溶劑強度參數(shù)和選擇性溶劑的強度參數(shù)定義：溶劑強度參數(shù)用表示。流動相強度越高，表示它與吸附劑相互作用力強。溶質的Rf值就越大。為得到滿意的分離，選用的流動相使溶質的Rf值在0.3–0.7之間為宜。溶劑強度也可用其在水中的溶解度參數(shù)來表示。2/5/202325一些常用溶劑的溶劑強度與溶解度參數(shù)溶劑

溶劑

正己烷0.017.3環(huán)己烷0.048.2苯0.329.2乙醚0.387.4二氯甲烷0.429.6正丙醇0.8210.2正丁醇0.70/四氫呋喃0.579.1乙酸乙酯0.588.6氯仿0.409.1甲乙酮0.51/二氧六環(huán)0.569.8吡啶0.7110.4丙酮0.509.4乙醇0.88/乙酸1.0012.4二甲亞砜0.7512.8甲醇0.9512.9乙二醇1.1114.7甲酰胺/17.92/5/202326流動相選擇時需考慮溶劑的下列情況一些溶劑如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保護劑，有時需重蒸除去乙醇。許多溶劑有吸濕性，使溶劑含水量不一致，導致實驗難以重現(xiàn)。溶劑儲藏時間和條件對溶劑質量影響，應注意出廠日期?；旌狭鲃酉嘟M分之間（或雜質）可能發(fā)生相互作用。對于易揮發(fā)的溶劑，難于配制穩(wěn)定組成的流動相。要求操作格外小心，同時混合流動相不應重復使用。2/5/202327溶劑的選擇性指溶劑引起兩種溶質位移差別的能力，即分離度。R=1/4（-1）[k/（k+1）]

分離因子=k1/k2，k為k1和k2的平均值由上式可見，R取決于三個因子：理論塔片n主要是吸附劑性質的函數(shù)k反映了兩種溶質的平均遷移速度，其由流動相溶劑強度決定

取決于吸附劑和流動相的組成2/5/202328溶劑優(yōu)化規(guī)則：增加溶劑強度，使Rf值增大，但也可能降低分離能力。流動相中較強組分的體積比小于5%或大于50%，選擇性最大，此時最有利于溶質與流動相組分的選擇性相互作用。用乙醚或甲醇代替流動相中的一種較強組分，由于形成氫鍵可改善選擇性。若出現(xiàn)斑點拖尾，可向流動相中加少量水，或降低薄層活性，有利于改善分離。也可采用兩種強溶劑與一種弱溶劑組成的三元混合流動相，此時，溶劑強度由弱溶劑控制，而溶劑選擇性則由兩強溶劑控制。2/5/202329斑點的擴散與形狀在TLC中斑點的移動與擴散是二維的，因為斑點在展開方向和與之垂直方向上的擴散速度是不相等的，展開劑的移動速度也是不等的，在單位體積或單位質量薄層內(nèi)所含的溶劑量越接近溶劑前沿減少得越明顯，直至溶劑前沿時為零，這一現(xiàn)象稱為“溶劑的體積梯度”，在各種展開形式中均存在。當然，對于這一問題實際上只是在定量斑點濃度時才需要考慮。2/5/202330同時一種成分的色譜行為會受到混合物中其他成分的影響，這種影響的大小取決于混合成分的種類、濃度、以及斑點間的距離等。這種影響一般使分配系數(shù)變小。如兩個相鄰斑點中后面的一個展開速度較其單獨展開時為大。2/5/202331固定相的活度及其調(diào)節(jié)在其他因素一定時，活度增加，Rf值減少，反之亦然?？赏ㄟ^預吸附溶劑分子，調(diào)節(jié)其表面活性。例如可將活化薄層板放在相對濕度恒定的空間里來達到調(diào)節(jié)活度的目的。實際工作中常常使固定相預吸附一定量單一或混合溶劑蒸氣，預吸附量越大，溶劑前沿運動速度越快，物質斑點的Rf值越小。預吸附還可能影響Rf在0.6-1.0之間的斑點的分離。2/5/202332在層析過程中發(fā)生的邊緣效應就是由于這種因素引起的。尤其是使用混合溶劑時，極性較弱和沸點較低的溶劑，在薄層邊緣容易揮發(fā)，使邊緣部分的展開劑中極性溶劑的比例增大，Rf相對增大。同一物質在同一薄層板上出現(xiàn)中間部分的Rf值比邊緣的Rf值小，即邊緣效應，若在展開前先將展開槽與薄層板用展開劑蒸氣飽和后再展開，邊緣效應可消失。采用雙槽層析缸尤為有利。2/5/202333預吸附中展開中展開過程中用不同于展開劑的溶劑調(diào)節(jié)槽內(nèi)氣氛2/5/202334薄層掃描原理薄層定量方法可分為直接法——測定照射光照射色譜后，因被測物斑點的存在引起的透射光和反射光的變化。并通過隨行標準比較待測斑點的量。間接法——將部分照射光的能量轉換成較長波長的熒光，即熒光測量。薄層色譜定量測定的光學方法是基于測量斑點和薄層空白處光學響應信號的差值。2/5/202335一強度為I的光照射薄層時，被照射的一面為“近表面”，另一面為“遠表面”。近表面遠表面光（I）鏡反射或表面反射Is(表面平滑)漫反射(表面粗糙)入射強度I0

出射強度(IT)IT/I0為薄層透射率AT返回光強(IR)IR/I0為介質的漫反射率ARI0-（IR+IT）=差為被介質吸收并轉換為熱的光強2/5/202336光學系統(tǒng)薄層色譜掃描儀光學系統(tǒng)有三種單光束單波長——受光源穩(wěn)定性和薄層質量影響嚴重。單光束雙波長——對背景不均勻引起的干擾有補償作用，選擇的兩個波長應接近些。雙光束單波長——可補償光源不穩(wěn)引起的誤差，但對板層不均勻無作用。光單色器檢測器光波長1波長2檢測器斬波器光單色器分光鏡檢測器檢測器2/5/202337透射光法測定組分對應的斑點對特定波長光的吸收度來確定含量。將薄層板從左至右移動，對斑點掃描，單色光透過薄層板后被記錄下來，將測得的吸收度對Rf值繪制掃描曲線，得薄層色譜圖光源單色器2/5/202338反射光法一定波長的光照射薄層，穿進薄層內(nèi)的光部分被薄層吸收，部分經(jīng)過漫反射又折回表面成為反射光。當對薄層進行掃描時，測量其反射吸收度，可得到反射光譜。反射吸收度與物質含量有確定關系，可進行定量。光源單色器2/5/202339掃描方式直線式掃描——照射在薄層板上的光束與薄層板作直線相對運動。光束固定，掃描板臺運動。光束落在薄層上的截面為一長方形帶。鋸齒式掃描——照射在薄層板上的光束與薄層板的相對運動軌跡呈鋸齒形或矩形。直線掃描鋸齒掃描輪廓曲線積分曲線2/5/202340斑點斑點A

B

CABCCAB對于不規(guī)則斑點，兩種掃描結果不一樣。同一斑點從A、B、C三個不同方向掃描，鋸齒掃描所得積分值變動小，而直線掃描所得積分值變動大。2/5/202341測量方式吸光度測量——測定的是漫反射光。適合于本身有顏色或有紫外吸收的物質。I0IR檢測器2/5/202342熒光測量——靈敏度較吸光度測量高，板層不吸收發(fā)射光，測量噪音小，基線穩(wěn)定。為消除激發(fā)光的影響，在板層和檢測器之間必須加一塊濾光片，以截去反射激發(fā)光，只讓發(fā)射的熒光抵達檢測器。濾光片熒光檢測器2/5/202343熒光淬滅測量——吸附劑有熒光，樣品斑點無熒光，在紫外光照射下，被測物在熒光背景上顯示出暗灰斑點。本法適合于本身無顏色，又無特征紫外吸收或熒光的物質。該測量技術有三種形式：測熒光測紫外光測紫外和熒光2/5/202344掃描儀機械掃描儀——可進行吸光度和熒光測量，以反射測量方式為主，也有能提供透射測量方式的（主要用于電泳譜圖掃描測量）。高速掃描系統(tǒng)——可分為兩類光柵掃描系統(tǒng)位敏掃描系統(tǒng)這類掃描儀技術上一些問題還未解決。2/5/202345掃描定量中的標準曲線校正薄層板上由于光被吸附劑散射，不能得到象通常溶液測定時的吸光度和濃度之間的簡單直線關系。即物質濃度越大，薄層試樣板上測定的反射吸光度比直線關系所示值越低。掃描儀系統(tǒng)設計時考慮到這一問題，采用微機處理使標準曲線直線化。在理論曲線上選擇吸光度0–1之間的7個點，將各吸光度值轉換為直線上的值，得到一條通過原點的直線。2/5/202346吸光度1.00物質量經(jīng)變換后的直線理論曲線直線化方法示意圖校正過度校正適當校正不足未校正試樣量積分值校正情況判斷2/5/202347使用直線化功能時的注意事項發(fā)色試樣的測定——對于沒有吸收的試樣進行發(fā)色測定時，一般不使用直線化功能就可以得到近似的直線關系。試樣變質時——試樣展開后，應馬上進行測定，如果放置一星期后再測定。即使近似地呈直線狀也往往不能通過原點，認為是試樣變質所引起的。展開距離——同一試樣等量點樣，同樣展開，展開距離不同將引起誤差。展開方法——使用直線化功能定量時，為避免展開距離不同產(chǎn)生的誤差，實際定量時，將已知濃度的標準品在同一塊板上展開是較理想的。2/5/202348定性、定量方法定性方法利用保留值測定Rf值測定相對Rf值，即Rx值。利用二維色譜（改變色譜條件，比較Rf值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2點樣第一次展開第二次展開2/5/202349通過板上化學反應反應后生成特征顏色的化合物反應后生成復雜的混合物，根據(jù)生成物的“指紋”特征加以鑒定?？捎糜诙ㄐ缘陌迳戏磻校阂阴；?、濃硫酸脫水、偶氮化、酯化、鹵化、酸堿水解