第五章酶分子修飾和改造

第五章酶的分子修飾和改造第一節(jié)酶化學(xué)修飾的原理和方法一、酶的化學(xué)修飾原因1．穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要。2．作用的最適條件不符。3．酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。4．臨床應(yīng)用的特殊要求。

酶化學(xué)修飾的應(yīng)用理論研究酶中特定基團(tuán)之間的距離氨基酸殘基的存在狀態(tài)氨基酸測序確定酶活性部位氨基酸數(shù)量測定醫(yī)藥解除醫(yī)用酶免疫源性和抗原性

提高醫(yī)用酶穩(wěn)定性延長醫(yī)用酶體內(nèi)半衰期生物技術(shù)領(lǐng)域改變酶最適pH

改變酶底物專一性有機(jī)溶劑可溶解酶提高酶耐熱、酸、堿、有機(jī)溶劑能力二、酶修飾的方向1．核酸水平：利用基因操作技術(shù)對(duì)DNA或mRNA進(jìn)行改造或修飾2．蛋白質(zhì)水平：人們用化學(xué)法或酶法對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造氨基酸的置換肽鏈有限切除氨基酸殘基的修飾等三、酶化學(xué)修飾的基本原理1．增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性酶與修飾劑交聯(lián)后，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，從而增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。2．保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶共價(jià)交聯(lián)后，其產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力能有效地阻擋抑制劑對(duì)酶的進(jìn)攻，同時(shí)“遮蓋”保護(hù)酶活性部位，使抑制劑和酶結(jié)合的難度增加，使酶的抗抑制劑能力增強(qiáng)。

三、酶化學(xué)修飾的基本原理3．維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶大分子修飾劑產(chǎn)生的空間障礙可阻擋蛋白水解酶接近酶分子，能“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。酶分子上許多敏感基團(tuán)參與修飾反應(yīng)，也減少了酶分子遭受蛋白水解酶攻擊破壞的可能性。

4.消除酶的抗原性有些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成共價(jià)鍵，破壞了酶分子上抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使酶抗原性降低乃至消除。能“遮蓋“抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。四、對(duì)修飾劑的了解1．修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度、對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性2．修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置3．修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件五、酶性質(zhì)的了解1．酶活性部位情況2．酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件3．酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等六、反應(yīng)條件的選擇1．反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例2．反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和pH條件3．反應(yīng)溫度及時(shí)間七、酶修飾方法1．酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾2．有機(jī)大分子對(duì)酶的化學(xué)修飾3．蛋白質(zhì)類及其他第二節(jié)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾一、幾種重要的修飾反應(yīng)1.?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)修飾劑：乙酰咪唑、二異丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O-甲基異脲等。修飾殘基：氨基、羥基、酚基、巰基等。2．烷基化反應(yīng)修飾劑：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰鹵代物等。修飾殘基：氨基、巰基、羧基、甲硫基、咪唑基等。3．氧化和還原反應(yīng)修飾劑：氧化試劑（H2O2、N-溴代琥珀酰亞胺等）；還原劑（2-巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇等）修飾殘基：巰基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二硫鍵（還原）。4．芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：四硝基甲烷修飾殘基：Tyr，Phe。二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1．巰基的化學(xué)修飾巰基是許多酶活性中心的催化基團(tuán)形成二硫鍵穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)最容易反應(yīng)的側(cè)鍵基團(tuán)之一通過修飾可提高酶的穩(wěn)定性烷基化試劑是一種重要的巰基修飾試劑，特別是碘乙酸和碘乙酰胺；常用N-乙基馬來酰亞胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ）。DTNB（Ellman試劑）用于定量酶分子中巰基數(shù)目。2．氨基的化學(xué)修飾Lys的氨基是酶分子中活性很高的基團(tuán)，容易被修飾。常用氨基修飾試劑：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）、碘代乙酸、還原烷基、。２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于測定酶蛋白中Lys數(shù)量。常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger試劑)、丹磺酰氯(DNS)修飾多肽鏈N末端，用于N末端的測定。3.羧基的化學(xué)修飾主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。產(chǎn)物一般為含酯類或酰胺類的修飾酶。水溶性的碳二亞胺為最常用的修飾劑，可定量測定羧基含量。．咪唑基的化學(xué)修飾：焦碳酸二乙酯。．胍基的化學(xué)修飾：丁二酮和1，2-環(huán)己二酮為修飾劑。．二硫基的化學(xué)修飾：通常通過還原的方法進(jìn)行修飾。7.分子內(nèi)交聯(lián)修飾采用含有雙功能基團(tuán)的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，與酶蛋白分子中兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)交聯(lián)，可以使酶分子的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾方法稱為分子內(nèi)交聯(lián)修飾。三、小分子修飾劑的作用1.用于酶分子結(jié)構(gòu)和功能的研究2.用于改進(jìn)酶性質(zhì)

第三節(jié)有機(jī)大分子對(duì)酶的修飾一、概念利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性二、常使用的水溶性大分子修飾劑糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、SephadexG-25）聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、丙烯酸等的單聚或共聚物）具有生物活性的大分子物質(zhì)（如肝素）、蛋白質(zhì)等。修飾的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等三、舉例3.1聚乙二醇及其修飾反應(yīng)聚乙二醇的特點(diǎn)：①線性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH；②具有良好的生物相容性和水溶性；③在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性；④末端活化后可與酶產(chǎn)生交聯(lián)；⑤覆蓋在酶分子表面形成疏松的親水外殼，導(dǎo)致流體動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變。（一）疊氮法將PEG的末端羥基轉(zhuǎn)化為疊氮基，然后與酶反應(yīng)。⑴PEG甲氧甲酰甲酯制備⑵PEG酰肼制備⑶PEG羧甲基疊氮化物制備⑷活化PEG與酶交聯(lián)

（二）琥珀酸酐法用二溴代琥珀酸酐在溫和堿性條件下將PEG活化，經(jīng)減壓濃縮得活化PEG，可與酶分子上氨基交聯(lián)。（三）三氯均嗪法PEG經(jīng)三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或減壓蒸餾，制得活化PEG。（四）羰二亞胺法修飾酶分子上的羧基。3.2糖類的修飾反應(yīng)（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修飾反應(yīng)1.溴化氰法右旋糖苷經(jīng)溴化氰活化后，在堿性條件下與酶的游離氨基共價(jià)連接，生成修飾酶。2.高碘酸氧化法高碘酸將右旋糖苷上鄰雙羥基氧化成醛基，醛基再與酶分子上的氨基結(jié)合而生成修飾酶。（二）糖肽的修飾反應(yīng)糖肽分子上有游離氨基，活化后能與酶分子上氨基反應(yīng)。①2,3-異氰酸甲苯活化法②戊二醛法3.3合成大分子多聚物修飾酶（一）聚N-乙烯吡咯烷酮N-乙烯吡咯烷酮修飾酶時(shí)，首先要開環(huán)水解，經(jīng)活化反應(yīng)，才能與酶聯(lián)結(jié)。（二）聚乙烯醇修飾酶聚乙烯醇與硝基苯酰氯反應(yīng)后，其產(chǎn)物的硝基用連二亞硫酸鈉還原成氨基，與酶分子中羧基共價(jià)連接。（三）聚氨基酸修飾酶聚賴氨酸修飾酶Lys上的氨基與含羧基較多的酶的羧基通過羰二亞胺產(chǎn)生交聯(lián)。3.4天然大分子對(duì)酶的修飾作用肝素修飾酶肝素由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成。羰二亞胺法用羰二亞胺活化肝素分子上的羧基后，與酶上的氨基共價(jià)連接。人血清白蛋白修飾酶戊二醛法利用戊二醛雙功能使白蛋白上的和酶分子上的氨基相互交聯(lián)。第四節(jié)其它修飾方法及修飾酶的性質(zhì)一、金屬離子置換修飾1．概念：通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法稱為金屬離子置換修飾。2．常用離子常用二價(jià)金屬離子。3．修飾方法二、肽鏈有限水解修飾用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽鏈為修飾劑，使肽鏈部分水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的性質(zhì)和功能。增加某些酶的活性減少或消除某些酶的抗原性。三氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的某些改變，從而改變酶的性質(zhì)和功能。提高酶活力或增加酶穩(wěn)定性。例：對(duì)β-干擾素修飾，將17位半胱氨酸→組氨酸，提高穩(wěn)定性

mRNAUGU,UGC→AUG,AGCDNAACA,ACG→TCA,TCG

將A突變成T，定點(diǎn)突變修飾酶的性質(zhì)1、修飾酶的熱穩(wěn)定性2、修飾酶的抗原性3、修飾酶對(duì)各類失活因子的抵抗力4、修飾酶在體內(nèi)的半衰期5、最適pH6、Km的變化第五節(jié)酶的生物改造一．理論來源二．概念三．定向進(jìn)化的選擇策略四．定向進(jìn)化的應(yīng)用一．理論來源利用基因工程原理可以在實(shí)驗(yàn)室中模擬生物進(jìn)化過程化學(xué)進(jìn)化生物進(jìn)化二．概念隨機(jī)突變+定向選擇＝目標(biāo)突變體細(xì)菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的突變酶。定向進(jìn)化不是定點(diǎn)突變定向進(jìn)化：突變篩選

突變位點(diǎn)是隨機(jī)的，不確定的；突變位點(diǎn)的數(shù)目也是不確定的；突變的效應(yīng)更是不可預(yù)知的；理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學(xué)的，生物的）都可以應(yīng)用于定向進(jìn)化中突變體的產(chǎn)生。定點(diǎn)突變：

突變位點(diǎn)是確定的，突變的個(gè)數(shù)也是預(yù)知的；突變的效應(yīng)可能是已知的，也可能是未知的；定點(diǎn)突變的方法一般是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的。三．定向進(jìn)化的選擇策略突變蛋白酶選擇平板初選，配合活性染色和X光片消化分析定向進(jìn)化的基本方法高突變菌株Stratagene

公司構(gòu)建了缺失DNA修復(fù)3個(gè)途徑的大腸桿菌菌株，基因突變率高5000倍易錯(cuò)PCRDNAshuffling體外定向進(jìn)化四定向進(jìn)化的應(yīng)用1．提高酶分子的催化活力L—天冬氨酸酶定向進(jìn)化研究進(jìn)行4輪易錯(cuò)PCR，篩選了3000個(gè)菌落。得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于天然酶2．提高酶分子的穩(wěn)定性T4溶菌酶11個(gè)不同的單點(diǎn)突變株將Tm提高0.8-1.4℃.8株大腸桿菌核酸酶HI單點(diǎn)突變中，7株Tm提高了0.7-4.2℃3．提高底物的專一性和增加對(duì)新底物的催化活力Beuve和Danchin展示腺苷酸環(huán)化酶突變后，鳥苷酸環(huán)化酶活力提高了4.5倍，但腺苷酸環(huán)化酶