第7章色譜分離技術(shù)

一、色譜分離技術(shù)的概念

色譜（chromatography）分離技術(shù)是一類分離方法的總稱，又稱色譜法、層析法、層離法等。它是利用不同組分在固定相和流動(dòng)相中的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分在兩相中以不同的速率移動(dòng)而進(jìn)一步分離的技術(shù)。第7章色譜分離技術(shù)在色譜法中，表面積較大的固體或附著在固體上且不運(yùn)動(dòng)的液體，靜止不動(dòng)的一相（稱為固定相

；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相。二、色譜分離系統(tǒng)的組成根據(jù)分離時(shí)一次進(jìn)樣量的多少，色譜分離的規(guī)模可分為色譜分析規(guī)模(小于10mg)、半制備(10~50mg)、制備規(guī)模(0.1~10g)和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模(>10g)。色譜分離的規(guī)模小，但產(chǎn)值高。三、色譜分離技術(shù)的分類超臨界流體色譜—流動(dòng)相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體三、色譜法的分類根據(jù)流動(dòng)相的相態(tài)不同:氣相色譜—以氣體作流動(dòng)相液相色譜—以液體作流動(dòng)相—固定相涂敷在玻璃或金屬板上—薄層色譜三、色譜法的分類根據(jù)固定相的附著方式分類

—液體固定相涂在紙上—紙色譜(平板色譜)—固定相裝在圓柱管中—柱色譜三、色譜法的分類吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法按分離機(jī)理不同，可分為：三、色譜法的分類根據(jù)操作壓力的不同分類：低壓色譜：操作壓力<0.5MPa中壓色譜：操作壓力0.5～4.0MPa高壓色譜：操作壓力4.0～40MPa三、色譜法的分類根據(jù)操作方法不同，色譜法可分為：前沿分析法（迎頭法）置換展開法（頂替法）洗脫展開法（洗脫分析法）

色譜法的缺點(diǎn)是處理量小、操作周期長(zhǎng)、不能連續(xù)操作。四、色譜法的特點(diǎn)(1)分離效果高(2)應(yīng)用范圍廣(3)選擇性強(qiáng)(4)設(shè)備簡(jiǎn)單吸附色譜法吸附色譜法(adsorptionchromatography，AC)是靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。吸附色譜的固定相為固體吸附劑，如有較強(qiáng)極性硅膠、中等極性氧化鋁、非極性炭及特殊作用的分子篩等。吸附色譜是靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。吸附力主要是范德華力，有時(shí)也可能形成氫鍵或化學(xué)鍵。吸附法的關(guān)鍵是選擇吸附劑和展開劑。1.基本原理吸附色譜分離過程示意圖

下列三個(gè)化合物用硅膠吸附色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（95：5）洗脫，判斷三者流出色譜柱先后順序。

ABC由先到后：C→B→A

舉例：平衡系數(shù)（分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)）K=cs/cm

cs—固定相中的濃度；cm—流動(dòng)相中的濃度影響K的因素：被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)、色譜柱的操作溫度。K差異越大，色譜分離效果越理想。阻滯因數(shù)（比移值）斑點(diǎn)到原點(diǎn)的距離Rf值=————————溶劑前沿到原點(diǎn)距離阻滯因數(shù)①0≤Rf≤1Rf越大，溶質(zhì)隨流動(dòng)相移動(dòng)快，被洗脫速率也就越快。②當(dāng)Rf=1，此種溶質(zhì)不溶于固定相，隨流動(dòng)相以同樣的速率移動(dòng)。③當(dāng)Rf=0，此種溶質(zhì)不溶于流動(dòng)相，而被吸附在固定相上。選用吸附色譜法分離化合物時(shí)，必須首先了解被分離化合物的性質(zhì)，然后選擇合適的吸附劑和展開劑。被分離化合物、吸附劑和展開劑三者關(guān)系配合恰當(dāng)才能得到較好的分離效果。2.吸附劑與展開劑薄層色譜法選擇的主要吸附劑為氧化鋁、硅膠和聚酰胺。色譜用的吸附劑要求一定的形狀與粒度范圍，不同吸附劑用于分離不同類型的化合物。吸附劑還必須具有一定的活度，活度太高或過低都不能使混合物各組分得到有效的分離。（1）薄層色譜的吸附劑與展開劑展開劑在吸附色譜中，組分的展開過程涉及吸附劑、被分離化合物和溶劑三種之間的相互競(jìng)爭(zhēng)。其基本原則主要有兩個(gè)：①展開劑對(duì)被分離組分有一定的解吸能力，但又不能太大。②展開劑應(yīng)該對(duì)被分離的物質(zhì)有一定的溶解度。展開劑常用溶劑極性次序?yàn)椋杭和?lt;環(huán)己烷<四氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸一般地說，所選的吸附劑應(yīng)有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對(duì)欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)該有不同的解吸能力；與洗脫劑、溶劑及樣品組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；還要求所選的吸附劑顆粒均勻，在操作過程中不會(huì)破裂。（2）柱色譜的吸附劑與洗脫劑吸附劑的選擇洗脫劑的選擇原則上要求所選的洗脫劑純度合格，與樣品和吸附劑不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)樣品的溶解度大，粘度小，容易流動(dòng)，容易與洗脫的組分分開。洗脫劑的選擇常用的洗脫劑有飽和的碳?xì)浠衔?、醇、酚、酮、醚、鹵代烷、有機(jī)酸等。選擇吸附劑時(shí)，可根據(jù)樣品的溶解度、吸附劑的種類、溶劑極性等方面考慮，極性大的洗脫能力大，因此可先用極性小的作洗脫劑，使組分容易被吸附，然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分容易從吸附柱中洗出。3.影響吸附分離的因素①和功能基極性有關(guān)。極性增加的順序：烷烴、不飽和烴、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧酸，同一類化合物極性基團(tuán)越多，極性越大。②小分子的化合物比大分子的化合物極性大。③和某些細(xì)微結(jié)構(gòu)有關(guān)，如氫鍵、異構(gòu)體等。二、吸附色譜分離操作及其設(shè)備1.薄層吸附色譜分離操作及設(shè)備（1）薄層色譜板的制備（2）點(diǎn)樣（3）展開（4）顯色①干法鋪板(軟板制備)多用于氧化鋁薄層板的制備。在一塊邊緣整齊的玻璃板上，鋪上適量的氧化鋁，取一合適物品頂住玻璃板右端。兩手緊握鋪板玻璃棒的邊緣，按箭頭方向輕輕拉過，一塊邊緣整齊、薄厚均勻的氧化鋁薄層即成。(1)薄層色譜板的制備干法制板可用于硅膠、聚酰胺、氧化鋁等薄層板的制備，但最常用的是硅膠硬板。為使制成的硅膠板堅(jiān)硬，要加入黏合劑，用硫酸鈣為粘合劑鋪成的板稱為硅膠G板，用羧甲基纖維素鈉作黏合劑鋪成的板為硅膠-CMC板。(2)濕法鋪板(硬板制備)聚酰胺膜多為外購(gòu)商品。2)點(diǎn)樣

用一根玻璃毛細(xì)管或點(diǎn)樣器，吸取樣品溶液，在距薄層一端約2cm的起始線上點(diǎn)樣，每點(diǎn)間距約2cm，樣品點(diǎn)直徑一般小于0.5cm。注意點(diǎn)樣量要適中，太少時(shí)，某些成分不能被檢出；太多時(shí)容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，即每個(gè)斑點(diǎn)都拉得很長(zhǎng)，互相重疊，不能分開。3）展開展開操作需要在密閉的容器中進(jìn)行。配好展開劑，將展開劑（一般2～10mL）倒入層析缸。放置一定時(shí)間，待層析缸被展開劑飽和后，再迅速將薄層板放入，密閉，展開即開始，這樣可防止邊緣效應(yīng)產(chǎn)生。另外，注意在薄板放入層析缸時(shí)，切勿使溶劑浸沒樣品點(diǎn)。當(dāng)溶劑移動(dòng)到接近薄層上端邊緣時(shí)，取出薄板，劃出溶劑前沿。展開方式可分三類：(1)上行展開法和下行展開法最常用的展開法是上行展開，就是使展開劑從下往上爬行展開；下行展開是使展開劑由上向下流動(dòng)。由于受重力作用，下行展開移動(dòng)較快。(2)單次展開法和多次展開法(3)單向展開法和雙向展開法

薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開劑層析缸展開劑濾紙條下行法薄層板薄層色譜法(Thin

Layer

Chromatography)4)顯色顯色也稱定位，即用某種方法使經(jīng)色譜展開后的混合物斑點(diǎn)呈現(xiàn)顏色，以便觀察其位置(1)紫外線照射法(4)生物顯跡法(2)噴霧顯色法(3)碘蒸汽顯色法2.吸附柱色譜分離操作及設(shè)備洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱色譜柱通常用玻璃柱。工業(yè)上大型色譜柱可以用金屬制造。柱的入口端應(yīng)該有進(jìn)料分步器，使進(jìn)入柱內(nèi)的流動(dòng)相分布均勻。有時(shí)也可在色譜柱頂端加一層多孔的尼龍圓片或保持一段緩沖液層。柱的底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板或玻璃細(xì)孔板支持固定相，最簡(jiǎn)單的也可以用鋪有濾布的橡皮塞。(1)色譜柱的選擇設(shè)計(jì)柱長(zhǎng)時(shí)需考慮下列幾點(diǎn)：(3)柱越長(zhǎng)，長(zhǎng)度和內(nèi)徑比越大，就越難得到均勻的填裝。大多數(shù)色譜柱的長(zhǎng)度25cm左右。(1)柱的最小長(zhǎng)度取決于所要達(dá)到的分離程度(2)較大的柱直徑需要較長(zhǎng)的色譜柱。①干法裝柱在柱下端加少許棉花或玻璃棉，再輕輕地撒上一層5mm厚的干凈砂粒，或放置大小合適的玻璃砂芯。打開下口，然后將吸附劑經(jīng)漏斗緩緩加入柱中，同時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使吸附劑松緊一致，最后，將色譜柱用最初洗脫劑小心沿壁加入，至剛好覆蓋吸附劑頂端平面，關(guān)緊下口活塞。(2)裝柱②濕法裝柱先在吸附劑中加入合適量的色譜最初用洗脫劑調(diào)成稀糊狀，再把放好棉花、沙子或合適大小的玻璃砂芯的色譜柱下口打開，然后徐徐將制好的糊漿灌入柱子。注意整個(gè)操作要慢，不要將氣泡壓入吸附劑中，而且要始終保持吸附劑上有溶劑，最后讓吸附劑自然下沉。當(dāng)洗脫劑剛好覆蓋吸附劑平面時(shí)，關(guān)緊下口活塞。(3)上樣①濕法上樣把被分離的物質(zhì)溶在少量色譜最初用的洗脫劑中，小心加在吸附劑上層，注意保持吸附劑上表面仍為一水平面，打開下口，待溶液面正好與吸附劑上表面一致時(shí)，在上面撒一層細(xì)砂，關(guān)緊柱活塞。②干法上樣可選用一種對(duì)其溶解度大而且沸點(diǎn)低的溶劑，取盡可能少的溶劑將其溶解。在溶液中加入少量吸附劑，拌勻，揮干溶劑，研磨使之成松散均勻的粉末，輕輕撒在色譜柱吸附劑上面，再撒一層細(xì)砂。(4)洗脫在裝好吸附劑的色譜柱中緩緩加入洗脫劑，進(jìn)行剃度洗脫，各組分先后被洗出。若用50g吸附劑，一般每份洗脫液量常為50mL。現(xiàn)多采用薄層色譜或紙色譜定性檢查各流分中的化學(xué)成分組成。含單一色點(diǎn)的部分用合適的溶劑析晶；仍為混合物的部分進(jìn)一步尋找分離方法再進(jìn)行分離。注意：整個(gè)操作過程必須注意不使吸附柱表面的溶液流干。應(yīng)控制洗脫液的流速。應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)完成一個(gè)柱層析的分離。洗脫操作的方式可分為：前沿分析法（迎頭法）：將混合物溶液連續(xù)通過色譜柱，只有吸附力量最弱的組分最先自柱中流出，其他各組分不能達(dá)到分離。置換展開法（頂替法）：利用一種吸附力比各被組分都強(qiáng)的溶劑作為洗脫劑，替代結(jié)合在固定相上的各組分。處理量大，且各組分分層清楚。洗脫展開法（洗脫分析法）：先將混合物盡量濃縮，引入色譜柱上部，然后用溶劑洗脫，使各組分分離完全。應(yīng)用最廣。三、吸附色譜法的應(yīng)用主要用于具有不同官能團(tuán)或具有相同官能團(tuán)但數(shù)目不同的極性化合物及異構(gòu)體等生物小分子物質(zhì)的分離分析。離子交換色譜法離子交換色譜法(ionexchangechromatography，IEC)是利用離子交換樹脂為固定相，以適宜的溶劑作為移動(dòng)相，使溶質(zhì)按它們的離子交換親和力的不同而得到分離的方法。一、基本原理離子交換色譜是指帶電物質(zhì)因電荷力作用而在固定相與流動(dòng)相之間分配得以相互分離的技術(shù)。蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)。當(dāng)pH<pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷；當(dāng)pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷。由于各種蛋白質(zhì)等生物大分子的等電點(diǎn)不同，可以通過改變?nèi)芤旱膒H和離子強(qiáng)度來影響它們與離子交換樹脂的吸附作用，從而將它們相互分離開來。離子交換的基本過程：(1)初始穩(wěn)定狀態(tài)(2)離子交換過程(3)洗脫過程(4)介質(zhì)的再生過程abcde離子交換的基本過程：

離子交換樹脂是一種不溶于酸、堿和有機(jī)溶劑的固體高分子聚合物。它具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)并含有活性基團(tuán)，能與溶劑中其他帶電粒子進(jìn)行離子交換或吸著。二、離子交換樹脂1.定義交換樹脂表面二、離子交換樹脂的分類

1.按樹脂骨架的主要成分(1)聚苯乙烯型樹脂由苯乙烯(母體)和二乙烯苯(交聯(lián)劑)的共聚物作為骨架，再引入活性基團(tuán)(2)丙烯酸樹脂由丙烯酸酯類和甲基丙烯酸酯類及其它烯屬單體共聚制成的樹脂。(3)多乙烯多胺-環(huán)氧氯苯烷樹脂由多乙烯胺與環(huán)氧氯苯烷的共聚物作為骨架。(4)酚-醛型樹脂主要由水楊酸、苯酚和甲醛縮聚而成，水楊酸和甲醛形成線狀結(jié)構(gòu)，苯酚作為交聯(lián)劑。2.按樹脂骨架的物理結(jié)構(gòu)(1)凝膠型樹脂(2)大網(wǎng)格樹脂(3)均孔樹脂1)陽離子交換樹脂活性基團(tuán)為酸性，對(duì)陽離子具有交換能力。3.按活性基團(tuán)分類(1)強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(2)弱酸性陽離子交換樹脂2)陰離子交換樹脂活性基團(tuán)為堿性，對(duì)陰離子具有交換能力。3.按活性基團(tuán)分類(1)強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂(2)弱堿性陰離子交換樹脂1977年，我國(guó)原石油化工部頒布了離子交換樹脂的命名法，規(guī)定離子交換樹脂的型號(hào)由三位阿拉伯?dāng)?shù)字組成：第一位數(shù)字代表產(chǎn)品的分類；第二位數(shù)字代表骨架；第三位數(shù)字微順序號(hào)。分類代號(hào)和骨架代號(hào)都分成7種，分別以0～6表示。

二、離子交換樹脂的命名代號(hào)分類名稱骨架名稱0強(qiáng)酸性苯乙烯系1弱酸性丙烯酸系2強(qiáng)堿性酚醛系3弱堿性環(huán)氧系4螯合性乙烯吡啶系5兩性脲醛系6氧化還原性氯乙烯系1.交聯(lián)度交聯(lián)度表示離子交換樹脂中交聯(lián)劑的含量，例如：聚苯乙烯型樹脂是由二乙烯苯將鏈狀分子聯(lián)成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的，而乙烯苯稱為交聯(lián)劑。樹脂中交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度。聚苯乙烯型交換樹脂含有8%的二乙烯苯，則此樹脂的交聯(lián)度為8%。一般樹脂的交聯(lián)度為8%～12%。

三、離子交換樹脂的理化性能2.交換容量：

交換容量是指每克干燥離子交換樹脂或每毫升完全溶脹的離子交換樹脂所能吸收的一價(jià)離子的毫摩爾數(shù)，以mmol/g表示，是表征樹脂離子交換能力的主要參數(shù)。交換容量的大小，取決于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中活性基團(tuán)的數(shù)目，含有活性基團(tuán)越多，交換容量也越大。但交換容量太大，活性基團(tuán)太多，樹脂不穩(wěn)定。粒度是樹脂顆粒在溶漲后的大小，色譜用50～100目樹脂，一般提取純化用20～60目(0.25~0.84mm)樹脂則可。粒度小的樹脂因表面大，效率高；粒度過小，堆積密度大，容易產(chǎn)生阻塞；粒度過大又會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)度下降、裝填量小、內(nèi)擴(kuò)散時(shí)間延長(zhǎng)，不利于有機(jī)大分子的交換。所以，粒度大小應(yīng)根據(jù)具體需要選擇。一般樹脂為球形，這樣可減少流體阻力。3.粒度和形狀強(qiáng)酸（或強(qiáng)堿）性離子交換劑的滴定曲線開始是水平的，到某一點(diǎn)突然升高（或降低），表明在該點(diǎn)交換劑上的離子交換基團(tuán)已被堿（或酸）完全飽和；弱酸（或弱堿）性離子交換劑的滴定曲線逐漸上升（或下降），無水平部分。利用滴定曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可估算離子交換劑的交換容量，而由轉(zhuǎn)折點(diǎn)的數(shù)目，可推算不同離子交換基團(tuán)的數(shù)目。

4.滴定曲線5.穩(wěn)定性樹脂應(yīng)有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，不容易分解破壞，不與酸、堿起作用。一般地說，陽離子交換樹脂比陰離子交換樹脂穩(wěn)定性好。交聯(lián)度小的穩(wěn)定性好。樹脂一般可反復(fù)使用上千次，穩(wěn)定性僅成為此要的考慮因素。但含苯酚的硫酸型樹脂及胺型樹脂不易與強(qiáng)強(qiáng)堿長(zhǎng)時(shí)間接觸。6．膨脹性(膨脹度)干樹脂浸在水溶液或有機(jī)溶劑中時(shí)，活性離子因熱運(yùn)動(dòng)可在樹脂空隙的一定距離內(nèi)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)由于存在著滲透壓使外部水分滲入內(nèi)部促使樹脂空隙擴(kuò)大而體積膨脹。測(cè)定膨脹前后樹脂的體積比，可得出膨脹度。在設(shè)計(jì)離子交換罐時(shí)，樹脂的裝填系數(shù)應(yīng)以工藝過程中膨脹度最大時(shí)的樹脂體積為上限參數(shù)，以免裝量過度或設(shè)備利用率降低。二、離子交換樹脂的性質(zhì)和種類三、離子交換樹脂的選擇依據(jù)離子交換交換色譜常用較細(xì)的樹脂(50~100目)。但一般樹脂的粒度較大，因此需要將樹脂粉碎、過篩后使用，過篩分干法和濕法兩種。干法較簡(jiǎn)單，但實(shí)際使用時(shí)粒度仍不均勻。利用水力浮選法，將樹脂分級(jí)比較方便。改變水的流速就可得到不同粒度的樹脂。三、離子交換樹脂的選擇依據(jù)樹脂的骨架結(jié)構(gòu)。目的分子的大小介質(zhì)上帶電功能基團(tuán)功能基團(tuán)的強(qiáng)弱四、流動(dòng)相的選擇依據(jù)離子交換色譜的流動(dòng)相必須是有一定離子強(qiáng)度的并且對(duì)pH有一定緩沖能力的溶液。使用緩沖液可穩(wěn)定流動(dòng)相的pH，使之在層析過程中不致發(fā)生明顯變化，同時(shí)還可以穩(wěn)定目的分子上的電荷量，保證層析結(jié)果的重現(xiàn)性。要使目的分子帶有電荷并以適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度結(jié)合到離子交換介質(zhì)上，需要選擇一合適的吸附pH。對(duì)于陰離子交換介質(zhì)，吸附pH至少應(yīng)高于目的分子等電點(diǎn)一個(gè)pH單位。四、流動(dòng)相的選擇依據(jù)吸附階段應(yīng)選擇允許目的分子與介質(zhì)結(jié)構(gòu)達(dá)到最高的離子強(qiáng)度。而洗脫時(shí)要選擇可使目的分子與介質(zhì)解吸的最低離子強(qiáng)度。這就定出了洗脫液離子強(qiáng)度的剃度起止范圍。在介質(zhì)再生之前往往還需用第三種離子強(qiáng)度更高的緩沖液流洗柱床以徹底消除可能殘留的牢固吸附雜質(zhì)。在大部分情況下，吸附階段溶液鹽濃度至少應(yīng)在10mmol/L以上。五、操作方法1.離子交換劑的處理2.裝柱及上樣裝柱主要是防止出現(xiàn)氣泡和分層，裝填要均勻。防止產(chǎn)生氣泡和分層的方法是裝柱時(shí)柱內(nèi)先保持一定高度的起始洗脫液(一般為柱高的1/3)，加入樹脂時(shí)使樹脂借水的浮力慢慢自然沉降。裝柱完畢后，用水或緩沖液平衡到所需的條件，如特定的pH、離子強(qiáng)度等。上樣加壓法是采用打氣入柱的方式進(jìn)行加壓，可用一個(gè)裝有樣品的分液漏斗與柱用橡皮塞連接，分液漏斗上端串有壓力劑并經(jīng)緩沖瓶與打氣管相連，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)就將打氣管夾緊。減壓法是在柱的排出口增設(shè)抽氣裝置，工業(yè)上多采用此法。3.洗脫分離不同的物質(zhì)選用不同的洗脫劑。原則是用一種更活潑的離子把交換在樹脂上的物質(zhì)再交換出來。常用的洗脫劑為酸類、堿類或鹽類溶液，改變整個(gè)系統(tǒng)的酸堿度和離子強(qiáng)度，以使交換物質(zhì)的交換性能發(fā)生變化，己交換上的物質(zhì)就逐漸被洗脫下來。為了提高分辨率，常采用剃度洗脫法。4凝膠色譜法凝膠色譜是基于分子大小不同而進(jìn)行分離的一種分離技術(shù)，又稱之凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾、阻滯擴(kuò)散層析或排阻層析。它具有一系列的優(yōu)點(diǎn)：操作方便、不會(huì)使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定的化合物、凝膠不用再生、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：分離速度較慢。一、基本原理小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠二、凝膠過濾介質(zhì)理想的凝膠過濾介質(zhì)具有高物理強(qiáng)度及化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿，具有高化學(xué)惰性，內(nèi)孔徑分布范圍窄，珠粒顆粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。1.葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是應(yīng)用最廣泛的一類凝膠，國(guó)外商品名為Sephadex。它由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，是以氫鍵交聯(lián)的。它與葡聚糖不同，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達(dá)到的。瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離操作的適宜工作條件是在pH為4.5～9，溫度0～40℃。瓊脂糖凝膠對(duì)硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。3.聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的。其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時(shí)不會(huì)有凝膠物質(zhì)被洗脫下來。在pH2~11范圍穩(wěn)定。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。4.疏水性凝膠常用的疏水凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝膠?！癝tyrogel”商品有11種型號(hào)，具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好。5.多孔玻璃珠多孔玻璃珠的化學(xué)和物理穩(wěn)定性號(hào)，機(jī)械強(qiáng)度高，不但抵御酶及微生物的作用，還能夠耐受高溫滅菌和較強(qiáng)烈的反應(yīng)條件。缺點(diǎn)是親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特性性吸附，而且可供連接的化學(xué)活性基團(tuán)也少。6.其他載體由聚丙稀酰胺和瓊脂糖混合組成的載體已投入應(yīng)用。它的特點(diǎn)是載體既有羥基又有酰胺基，并且都能單獨(dú)與配基使用。但這類載體不能接觸強(qiáng)堿，為了避免酰胺水解，使用溫度不能超過40℃。三、凝膠過濾介質(zhì)的選擇1.分離范圍2.分辨率3.穩(wěn)定性四、操作方法1.凝膠的預(yù)處理市售凝膠必須經(jīng)過充分溶漲后才能使用，如果溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過細(xì)的粒子。如此反復(fù)多次，直至上層澄清為止。2.層析柱的選擇層析柱的體積和高徑比與層析分離效果的關(guān)系相當(dāng)密切。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞。3.凝膠柱的裝填空柱中應(yīng)留1/5的水或溶劑。所用凝膠必須是經(jīng)過充分溶漲的。開始進(jìn)膠后應(yīng)當(dāng)打開柱端閥門并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結(jié)，對(duì)分離不利。進(jìn)膠過程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。為此，層析柱要始終保持垂直。凝膠懸液濃度也需控制，過稀和過濃都會(huì)產(chǎn)生不利影響。4.樣品處理和加樣分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。4.樣品處理和加樣加樣時(shí)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動(dòng)。(1)直接將樣品加到層析床表面(2)利用兩種液體相對(duì)密度不同而分層5.洗脫與收集為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降，整個(gè)洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。6.凝膠的保存(1)干法(2)濕法(3)半縮法5親和色譜親和色譜(affinitychromatography，AFC)利用固定相配基與生物大分子之間的特殊生物親和力的不同實(shí)現(xiàn)分離的。親和色譜廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等生物大分子以及細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等物質(zhì)的分離與純化。特別是對(duì)分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)最有效，經(jīng)一步親和色譜即可純化幾百至幾千倍。①選擇性高、特異性極強(qiáng)②操作條件溫和③回收率高親和色譜的局限性①普遍性、通用性不夠②費(fèi)用高親和色譜的特點(diǎn)1基本原理親和色譜是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子上具有特定構(gòu)象的結(jié)構(gòu)域與配體的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合，具有高度的特異性和親和力。親和層析過程2親和吸附劑的制備1.載體的選擇①載體必須具有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，非專業(yè)吸附小。②具有大量可供活化和配基結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，以供與配基共價(jià)連接之用。③載體必須具有高度的水不溶性和親水性。④載體必須有稀松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使大分子能自由進(jìn)入⑤載體要有良好的機(jī)械性能，顆粒均勻。1.載體的選擇常用的親和色譜載體主要有多孔玻璃載體、聚丙稀酰胺載體、纖維素載體、葡聚糖凝膠載體、瓊脂糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體等。2.配基的選擇根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì)，可將其分為兩類：特殊配基和通用配基。親和層析中常用的特殊配基有某一抗原的抗體、某一酶的專用抑制劑、某一激素的受體等。通用配基可適用于一類物質(zhì)的分離提純，如用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基。2.配基的選擇首先，應(yīng)當(dāng)僅僅識(shí)別被純化的目的物(配體)。其次，配體與配基應(yīng)該有足夠大的親和力。再次，配基與相應(yīng)目的物之間的結(jié)合應(yīng)具有可逆性。第四，配體具有足夠的穩(wěn)定性，能夠耐受反應(yīng)條件以及清洗合再生等條件。最后，配基的分子大小必須合適。3.載體的活化與偶聯(lián)載體由于其相對(duì)的惰性，往往不能直接與配基連接，偶聯(lián)前一般需先活化，載體表面經(jīng)過活化后產(chǎn)生的活性基團(tuán)可以在簡(jiǎn)單的化學(xué)條件下與配基上的氨基、羧基、羥基和醛基等功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合反應(yīng)，這一過程稱為配基的鍵合。載體表明的基團(tuán)必須具有通用性合高效性，可以與上述配基上的常見基團(tuán)發(fā)生簡(jiǎn)單、快速的反應(yīng)。3.載體的活化和配基的連接1.溴化腈活化法2.環(huán)氧基活化法3.硅膠的活化3影響吸附劑親和力的因素

1.配基濃度對(duì)于親和力低的系統(tǒng)，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配基的有效濃度。2.空間障礙在制備有些吸附劑時(shí)需要在載體與配基之間插入一段適當(dāng)長(zhǎng)度的多烴鏈“手臂”，以增加與載體相連的配基的活動(dòng)度并減輕載體的立體障礙。3影響親和作用的因素

3.配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)在多肽或蛋白質(zhì)等大分子作配基時(shí)，必須使它以最少的鍵與載體連接。4.載體孔徑載體孔隙是配體向配基接近的運(yùn)動(dòng)通道，所以載體的孔徑大小對(duì)吸附劑的親和能力有決定性影響。4親和色譜操作條件的選擇1.吸附條件的選擇①吸附反應(yīng)條件

最好是自然狀態(tài)下配體與目的分子之間反應(yīng)的最佳條件。②流速控制

不能太快③吸附時(shí)間的控制

延長(zhǎng)時(shí)間可促進(jìn)吸附④進(jìn)樣量的大小

減少進(jìn)樣量，可提高吸附效果。4親和色譜操作條件的選擇2.清洗條件的選擇洗滌緩沖液的強(qiáng)度應(yīng)介于目的分子吸附條件與目的分子洗脫條件之間4親和色譜操作條件的選擇3.洗脫條件的選擇在實(shí)際操作過程中，應(yīng)該在洗脫強(qiáng)度和耐受程度之間做好平衡。5操作方法1.樣品制備一般地說，雜質(zhì)的非特異性吸附量與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基固定化方法以及流動(dòng)相的離子強(qiáng)度、pH和溫度等因素有關(guān)。親和色譜樣品預(yù)處理的主要程序：①顆粒、細(xì)胞碎片、膜片段等的去除；②樣品的濃縮及除去蛋白酶或抑制劑。5操作方法2.配基與目的物結(jié)合條件的選擇配基與目的物的特異性結(jié)合需要最適的pH、緩沖液鹽濃度和離子強(qiáng)度。pH不僅能調(diào)節(jié)配基的電荷基團(tuán)，也能調(diào)節(jié)目的物的電荷基團(tuán)。中等鹽濃度的緩沖液能穩(wěn)定溶液中蛋白質(zhì)并防止由于離子交換所引起的非特異性相互作用。5操作方法3.柱操作柱的大小取決于吸附劑的容量和所需純化的蛋白質(zhì)的量。一般地說，高的容量可以用于粗的短柱，大多數(shù)情況下，可以采用一次性的塑料小柱和1～5mL凝膠。5操作方法4.流速的控制提高流速可提高分離速度，但柱效降低。因此，吸附操作要在適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)下進(jìn)行，既要保證高速度，又要保證高效率。為了使純化蛋白能夠得到好的洗脫峰、最小的稀釋度和最大的回收率，最好使用低流速。5操作方法5.清洗清洗過度會(huì)使目標(biāo)產(chǎn)物的損失增多，而清洗不充分則使洗脫回收的目標(biāo)產(chǎn)物純度降低。具體操作是樣品吸附在上柱之后，必須用幾倍體積的起始緩沖液對(duì)柱清洗以除去不結(jié)合的所有物質(zhì)。5操作方法6.洗脫特異性洗脫利用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物溶液作為洗脫劑，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用，是較多采用的洗脫方法。5操作方法7.柱的再生具體操作是用幾倍體積的起始緩沖液進(jìn)行再平衡，一般足以使親和柱再生，但一些未知的雜質(zhì)往往仍結(jié)合在柱上，必須用苛刻的條件才能除去。根據(jù)載體材料的不同、配基的性質(zhì)以及它與載體連接方式的不同可酌情處理。高效液相色譜法(highpressureLiquidchromatography，HPLC)是利用物質(zhì)在兩相之間吸附或分配的微小差異達(dá)到分離的目的。當(dāng)兩相作相對(duì)移動(dòng)時(shí)，被測(cè)物質(zhì)在兩相之間做反復(fù)多次的分配，這樣使原來微小的差異產(chǎn)生了很大的分離效果，達(dá)到分離、分析和測(cè)定一些理化常數(shù)的目的。6高效液相色譜法HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓填料顆粒大柱效低分析速度慢色譜柱只用一次不能在線檢測(cè)高壓，40～50Mpa填料顆粒小，2～50μm柱效高，40000～60000塊/m分析速度快色譜柱可重復(fù)多次使用能在線檢測(cè)與氣相色譜比較高效液相色譜以溶劑作流動(dòng)相，流動(dòng)相參與分離作用，分離能力強(qiáng)；適用范圍廣，氣相色譜分離分析的化合物只占化合物的30％，而高效色譜對(duì)高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、大分子量、離子型化合物等都有效，適合于生命物質(zhì)的分析；分析過程中一般不破壞物質(zhì)，因而可以方便地制備色譜純物質(zhì)。HPLC與GC差別2/5/2023HPLC有以下特點(diǎn)：高壓——壓力一般100~300kg/cm2。高速——流速為1~10ml/min。高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-10g/L。同時(shí)消耗樣品少。高效——可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種適用范圍廣——可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質(zhì)或受熱不穩(wěn)定的物質(zhì)一、HPLC的分類和基本原理色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。高效液相色譜法按固定相的名稱可分為液－液色譜和液－固色譜，按分離機(jī)制的不同分為：液固吸附色譜法液液分配色譜法（正相與反相）離子交換色譜法離子對(duì)色譜法分子排阻色譜法一、HPLC的分類和基本原理二、設(shè)備配置

高壓輸液系統(tǒng)(輸液泵)、進(jìn)樣系統(tǒng)(進(jìn)樣器)、分離系統(tǒng)(色譜柱)和檢測(cè)系統(tǒng)(檢測(cè)器)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，高壓泵將貯液器中流動(dòng)相經(jīng)過進(jìn)樣器，將樣品帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來，得到液相色譜圖。液相色譜儀器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色譜儀（1）液相色譜儀（2）液相色譜儀（3）液相色譜儀（4）流程及主要部件

（processandmainassemblyofHPLC）梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到。三、固定相1.固定相的特性①較細(xì)的顆粒。一般為5～10μm。②粒度均勻一致。③機(jī)械強(qiáng)度好，具有良好的耐高壓剛性。④如果為多孔性顆粒，則孔徑分布也要均勻。⑤化學(xué)和熱穩(wěn)定性好，耐酸堿，不容易產(chǎn)生不可逆吸附。

三、固定相HPLC固定相骨架顆粒材料可分為無機(jī)和有機(jī)兩類，無機(jī)類中應(yīng)用最多的是硅膠，其他如多孔玻璃、羥基磷灰石、石墨炭黑等。有機(jī)類主要為有機(jī)高分子合成材料，最為常見的是交聯(lián)聚苯乙烯，其他常用的還有高交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚乙烯吡啶和交聯(lián)聚乙醇等。2.固定相的分類1）液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁和多孔聚合物；結(jié)構(gòu)類型：全多孔高效吸附劑、全多孔低效吸附劑和表面多孔吸附劑。(1)硅膠分為薄殼玻璃珠、無定形全多孔硅膠及堆積硅珠等類型。(2)氧化鋁分為球形和無定形兩種，粒度5～10μm。對(duì)不飽和的碳?xì)浠衔锖秃u素化合物的分離效果較好。在硅膠上吸附太強(qiáng)的化合物可試用氧化鋁。(3)多孔聚合物以聚苯乙烯膠體為代表，在pH1～14中穩(wěn)定。特點(diǎn)是選擇性好、峰形好，但硬度不高。(薄殼型微珠擔(dān)體)30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底。2)液-液分配色譜固定相(1)正、反相色譜流動(dòng)相極性小于固定相的分配色譜法稱為正相色譜法。以含水的硅膠為固定相，烷烴為流動(dòng)相的色譜法是正相液-液分配色譜的代表。正相色譜法主要靠組分的極性差別分離，適用于含有不同官能團(tuán)物質(zhì)的分離。流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相色譜法。在進(jìn)行反相洗脫時(shí)，樣品中極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱，主要分離對(duì)象是極性小的物質(zhì)。

（2）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相是應(yīng)用最廣的色譜法。將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相，其特點(diǎn)是不流失，一般認(rèn)為有分配與吸附兩種功能。

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N（2）化學(xué)鍵合固定相≡Si-O-Si-C鍵型鍵合相，按極性分為非極性、極性和中性三種類型。中等極性鍵合相較少使用。A.非極性鍵合相非極性鍵合相又稱反相鍵合相，其表面基團(tuán)為非極性烴基，如十八烷基、辛烷基、乙基、甲基和苯基鍵合相。代表產(chǎn)品是十八烷基硅烷-硅膠，是最常用的非極性鍵合相。鍵合相優(yōu)點(diǎn)是使用過程中不流失、熱穩(wěn)定性好、適于剃度洗脫等，其流動(dòng)相常用甲醇-水或乙腈-水，主要分離對(duì)象是非極性或弱極性化合物。（2）化學(xué)鍵合固定相B.極性鍵合相極性鍵合相指鍵合有機(jī)分子中含某些極性基團(tuán)，與空白硅膠相比，其