第二章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)

第二章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)通論

蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類(lèi)凱氏定氮法蛋白質(zhì)含量的測(cè)定——?jiǎng)P氏定氮法

氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的大概含量。一般，樣品含氮量平均在16%，取其倒數(shù)100/16=6.25，即為蛋白質(zhì)換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說(shuō)明含有6.25g蛋白質(zhì)；

※蛋白質(zhì)含量=氮的量×6.25

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)原料無(wú)選擇性，儀器簡(jiǎn)單，方法簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)：易將無(wú)機(jī)氮(如核酸中的氮)，都?xì)w入蛋白質(zhì)中，不精確。

單純蛋白質(zhì)的分類(lèi)這類(lèi)蛋白質(zhì)只含由-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。清蛋白和球蛋白：(albuminandglobulin)廣泛存在于動(dòng)物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于70－80％乙醇中。精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細(xì)胞核中。硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。結(jié)合蛋白質(zhì)的分類(lèi)糖蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與糖類(lèi)物質(zhì)組成。如細(xì)胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與脂類(lèi)結(jié)合而成。含三酰甘油、膽固醇、磷脂。如血清-，-脂蛋白等。核蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。色蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素等磷蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。蛋白質(zhì)分子的形狀和大小

根據(jù)形狀和溶解度分為三大類(lèi)：(globularprotein)(membraneprotein)(Fibrousprotein)蛋白質(zhì)的大小12600估算氨基酸殘基數(shù)目

對(duì)于不含輔基的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)，用110除它的相對(duì)分子質(zhì)量，即可約略估算出其殘基數(shù)。蛋白質(zhì)中20種氨基酸的平均相對(duì)分子質(zhì)量約為138，但在多數(shù)蛋白質(zhì)中較小的氨基酸占優(yōu)勢(shì)，因此平均相對(duì)分子質(zhì)量約128每形成一個(gè)肽鍵失去一分子水（相對(duì)分子質(zhì)量18），氨基酸殘基的平均相對(duì)分子質(zhì)量約為110。蛋白質(zhì)功能的多樣性

1.酶：作為酶的化學(xué)本質(zhì)，溫和、快速、專(zhuān)一，任何生命活動(dòng)之必須，酶的另一化學(xué)本質(zhì)是RNA，不過(guò)它比蛋白質(zhì)差遠(yuǎn)了，種類(lèi)、速度、數(shù)量。

2.免疫系統(tǒng)：防御系統(tǒng)，抗原（進(jìn)入“體內(nèi)”的生物大分子和有機(jī)體），發(fā)炎。

細(xì)胞免疫：T細(xì)胞本身，分化，膿細(xì)胞。

體液免疫：B細(xì)胞，釋放抗體，免疫球蛋白（Ig）。

3.肌肉：肌肉的伸張和收縮靠的是肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白互動(dòng)的結(jié)果，體育生化。

4.運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧氣：Hb和Mb。

蛋白質(zhì)功能的多樣性

5.激素：含氮類(lèi)激素，固醇類(lèi)激素。

6.基因表達(dá)調(diào)節(jié)：操縱子學(xué)說(shuō)，阻遏蛋白。

7.生長(zhǎng)因子：EGF（表皮生長(zhǎng)因子），NGF（神經(jīng)生長(zhǎng)因子），促使細(xì)胞分裂。

8.信息接收：激素的受體，糖蛋白，G蛋白。

9.結(jié)構(gòu)成分：膠原蛋白（肌腱、筋），角蛋白（頭發(fā)、指甲），膜蛋白等。生物體就是蛋白質(zhì)堆積而成，人的長(zhǎng)相也是由蛋白質(zhì)決定的。

10.精神、意識(shí)方面：記憶、痛苦、感情靠的是蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，蛋白質(zhì)的構(gòu)象分類(lèi)是目前熱門(mén)課題。

11.蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì)？只有不確切的少量證據(jù)。如庫(kù)魯病毒，怕蛋白酶而不怕核酸酶。

二.肽

一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱(chēng)為肽鍵，所形成的化合物稱(chēng)為肽。由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱(chēng)為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱(chēng)為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱(chēng)為氨基酸殘基。

在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱(chēng)為氨基酸順序。通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱(chēng)為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱(chēng)為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開(kāi)始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽與肽鍵肽與肽鍵

肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。肽鍵平面不可能的空間構(gòu)象

在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類(lèi)多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱(chēng)為活性肽。如：腦啡肽；激素類(lèi)多肽；抗生素類(lèi)多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。天然存在的重要多肽

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-腦啡肽Leu-腦啡肽谷胱甘肽二硫鍵

1.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primarystructure)包括：(1)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目.(2)多肽鏈的氨基酸順序，(3)多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置?！锲渲凶钪匾氖嵌嚯逆湹陌被犴樞颍堑鞍踪|(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。2.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。(1)測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求

三.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定A.樣品必需純（>97%以上）；B.知道蛋白質(zhì)的分子量；C.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；D.測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。E.測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。(2)測(cè)定步驟測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

2.多肽鏈的拆分：由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱(chēng)為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基).3.二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^(guò)加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

★巰基的保護(hù)4.測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比；5.分析多肽鏈的N-末端和C-末端

★末端氨基酸的測(cè)定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi)，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測(cè)定的主要方法有：

二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯法(DNS):在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到110-9mol。肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物,即(n-1)個(gè)氨基酸酰肼。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。D.氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。

E.羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來(lái)自胰臟；C來(lái)自柑桔葉；Y來(lái)自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。6.多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開(kāi)來(lái)。氨基酸順序自動(dòng)分析儀只能準(zhǔn)確測(cè)定50aa以下的肽鏈，而一般的蛋白質(zhì)都含有100以上的aa殘基，所以，事先要將蛋白質(zhì)打斷成多肽甚至寡肽，再上機(jī)分析，而且要2套以上，便于以后拼接。酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化學(xué)法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。多肽的選擇性降解的方法7.測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。8.確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟1、蛋白質(zhì)的分離純化Purification2、二硫鍵的拆分與保護(hù)S-Scleavage&blocking3、(亞基分離）Subunitseparation4、多種方法的部分水解Partialh.5、分離水解后得到的多肽Peptides.6、測(cè)序Sequencing7、重疊Overlapping、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)信息庫(kù)（ProteinInformationResource,PIR）基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank,GenSequenceDataBank）歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)(EuropeanMolecularBiologyLaboratoryDataBank,EMBL)四.蛋白質(zhì)的氨基酸序列

與生物功能同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化1同源蛋白質(zhì)在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)不變殘基（invariantresidue） 可變殘基（variableresidue）2細(xì)胞色素C(cytochromec)

來(lái)自任兩個(gè)物種的同源蛋白質(zhì)，其序列間的氨基酸差異數(shù)目與這些物種間的系統(tǒng)發(fā)生差異是成比例的，即在進(jìn)化位置上相差愈遠(yuǎn)，其氨基酸序列之間的差別愈大。60個(gè)物種中，有28個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基?？勺儦埢赡茈S著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹(shù)）。細(xì)胞色素C黃色：不變殘基（invariableresidues）藍(lán)色：保守氨基酸（conservativeresidues）未標(biāo)記：可變殘基（variableresidues）細(xì)胞色素C系統(tǒng)樹(shù)（進(jìn)化樹(shù)）

同源蛋白具有共同的進(jìn)化起源

肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）：哺乳動(dòng)物的肌肉中儲(chǔ)存氧氣的蛋白質(zhì)，水生的哺乳動(dòng)物體內(nèi)尤為發(fā)達(dá)（如鯨魚(yú)），因此，它們可以憋氣很長(zhǎng)時(shí)間，研究用Mb一般由鯨魚(yú)提供。

一級(jí)結(jié)構(gòu)：?jiǎn)螚l肽鏈，153個(gè)aa，其中的83個(gè)aa為保守序列（即同源蛋白質(zhì)均相同，是決定功能的最重要序列），含有一分子血紅素輔基，其中保持Fe2+，血紅素通過(guò)Fe2+以配位鍵吊在肽鏈的His的咪唑基上。O2將結(jié)合在Fe2+上。

血紅蛋白（