版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
第五章離子交換層析(Ionexchangechromatography)2/4/2023海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss1離子交換層析的概念離子交換層析是利用分離物(蛋白質(zhì))表面的荷電的離子或基團(tuán)與帶相反電荷的不溶性基質(zhì)(離子交換劑)進(jìn)行可逆的交換。更確切地,是先用蛋白質(zhì)偶極離子置換基質(zhì)官能團(tuán)上的平衡離子(反離子),然后蛋白質(zhì)本身又隨著平衡離子的比例的增加而被置換下來(lái)。根據(jù)蛋白質(zhì)各組分所帶電荷的性質(zhì)及電荷量的差異,被置換的速度不同而在層析過(guò)程中達(dá)到分離。2/4/20232內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類(lèi)與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2/4/20233第一節(jié) 基本原理1.離子交換劑2.交換反應(yīng)3.原理4.離子交換劑與離子結(jié)合的關(guān)系5.兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力2/4/20234離子交換層析是在以離子交換劑為固定相,液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。2/4/20235
纖維素-O-CH2-COO一—Na+
基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子
羧甲基纖維素離子交換劑組成示意圖1.離子交換劑(1)離子交換劑:即是通過(guò)化學(xué)鍵合的方法向惰性支持物上連接可解離的化學(xué)基團(tuán)后的產(chǎn)物。由基質(zhì)、電荷基團(tuán)(或功能基團(tuán))和反離子構(gòu)成。2/4/20236陰離子交換劑與陽(yáng)離子交換劑的基本構(gòu)成:
基質(zhì)-電荷基團(tuán)-反離子(反離子基團(tuán))陰離子交換劑陽(yáng)離子交換劑2/4/20237RA+B+
RB+A+
RA代表陽(yáng)離子交換劑,它在溶液中解離出來(lái)的陽(yáng)離子A+與溶液中的陽(yáng)離子B+能發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。2.交換反應(yīng)2/4/20238離子交換反應(yīng):R-A++B+R-B++A+平衡常數(shù)表示離子交換劑對(duì)溶液中不同離子的親和力:[A][B]AB[RB][RA]++K
=[A]=[B]KA
B=[RB][RA]++KAB=1[RA]>[RB]KAB>1[RA][RB]KAB1<<[RB]=[RA]2/4/20239KAB值反映離子交換劑對(duì)不同離子的親合力或選擇性的參數(shù),稱(chēng)KAB值為離子交換劑對(duì)A+和B+的選擇系數(shù)。2/4/2023103.離子交換層析的原理利用蛋白質(zhì)及欲分離的生物分子帶電性質(zhì)的差異為分離依據(jù);帶電荷的蛋白質(zhì)樣品可以與離子交換劑的帶正電荷或負(fù)電荷的基團(tuán)結(jié)合;蛋白質(zhì)樣品同離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷基團(tuán)的靜電吸引力,pH影響這種吸引力;蛋白質(zhì)的洗脫通過(guò)改變洗脫液的鹽離子強(qiáng)度和pH來(lái)完成。2/4/202311
大分子依其與離子交換劑親和力的不同,而以不同牢度被吸附于離子交換劑上,通過(guò)改變離子強(qiáng)度或(和)pH使大分子再?gòu)碾x子交換劑上先后被洗脫下來(lái)。2/4/202312混合樣品帶負(fù)電荷,與陰離子交換劑結(jié)合。樣品堿性較弱,吸附力較弱,用低濃度鹽洗脫。樣品堿性強(qiáng),與交換劑結(jié)合牢,解脫難。用高濃度鹽洗脫。各樣品帶電荷不同,與離子交換劑的結(jié)合能力不同。依解離的難易的差異,而達(dá)到分離。2/4/202313離子交換層析示意圖2/4/2023海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss14Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------2/4/202315Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead2/4/202316Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----2/4/202317Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--2/4/202318Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++2/4/2023194.離子交換劑與離子結(jié)合的關(guān)系強(qiáng)酸性離子交換劑、強(qiáng)堿性離子交換劑對(duì)各種反離子的結(jié)合與否以及結(jié)合力的強(qiáng)弱遵循一定的規(guī)律;并對(duì)樣品選擇離子交換劑、洗脫液離子類(lèi)型、pH狀態(tài)都至關(guān)重要。離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力是與離子的電荷量成正比,與水合離子的半徑的平方成反比關(guān)系。2/4/202320離子交換劑在溶液中與水合離子結(jié)合能力的趨勢(shì)結(jié)論:離子價(jià)數(shù)愈高,結(jié)合力愈大。離子間電荷相同時(shí),離子的原子序數(shù)愈高,水合離子半徑愈小,結(jié)合力愈大。故元素周期表中離子結(jié)合力的趨勢(shì)的方向?yàn)椋簭男≈链蟆?P71表5-1)2/4/2023215.兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力蛋白質(zhì)、酶、多肽、核苷酸及核酸等兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力取決于其本身的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH﹤pI,帶正電荷,被陽(yáng)離子交換劑吸附。pH﹥pI,帶負(fù)電荷,被陰離子交換劑吸附。pI離pH愈遠(yuǎn),分離物所帶電荷越強(qiáng),越容易被離子交換劑吸附,吸附力強(qiáng),越難解吸附。2/4/202322內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類(lèi)與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2/4/202323第二節(jié) 離子交換劑的分類(lèi)與性質(zhì)離子交換劑的基本要求:1.高度的不溶性;2.多孔的結(jié)構(gòu),巨大的表面積;3.豐富的交換基團(tuán);4.穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。2/4/202324一、分類(lèi)A.陽(yáng)離子交換劑是在不溶性載體上,結(jié)合有中性pH下帶負(fù)電荷的官能團(tuán)(羧甲基或磺丙基基團(tuán))。這類(lèi)樹(shù)脂適合于分離等電點(diǎn)在中性以上的蛋白質(zhì)。三角形代表負(fù)電荷的官能團(tuán),釋放的反離子帶正電荷。+--+++--2/4/202325陰離子交換劑帶正電荷官能團(tuán),反離子帶負(fù)電荷。B.陰離子交換劑的官能團(tuán)(二乙氨乙基DEAE或季氨堿QAE)樹(shù)脂在中性pH條件帶正電荷。釋放的反離子帶負(fù)電荷,在中性pH時(shí)能與酸性蛋白質(zhì)相互作用。+__++_2/4/202326離子交換樹(shù)脂的基本類(lèi)型陽(yáng)離子交換劑強(qiáng)酸性弱酸性陰離子強(qiáng)堿性交換劑弱堿性交換基團(tuán)磺酸基羧酸基季銨基伯、仲銨基交換離子-SO3H-COOH-NH3-NHR、-NH2工作范圍(pH)1~147~140~120~7水解穩(wěn)定性穩(wěn)定易水解穩(wěn)定易水解離子吸附速度大H型小大OH型小2/4/202327請(qǐng)記?。宏?yáng)離子交換劑本身帶酸性基團(tuán),在其pK以上荷負(fù)電。陽(yáng)離子分為:強(qiáng)酸性、中強(qiáng)酸性、弱酸性陰離子交換劑本身帶堿性基團(tuán),在其pK以下荷正電。陰離子分為:強(qiáng)堿性、中強(qiáng)堿性、弱堿性2/4/2023281.疏水性離子交換劑疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是人工合成的、與水結(jié)合力較小的物質(zhì),稱(chēng)為樹(shù)脂。其基質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是苯乙烯和二乙烯苯合成呈網(wǎng)狀的聚合體,引入不同的電荷基團(tuán)。2/4/202329疏水性離子交換劑具有如下特性而被廣泛應(yīng)用:
大量的活性基團(tuán)較高的交換容量良好的機(jī)械強(qiáng)度穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)均勻的球形顆粒、型號(hào)齊全以及豐富的產(chǎn)品2/4/2023302.親水性離子交換劑親水性離子交換劑的基質(zhì)是一類(lèi)天然的或人工合成的、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)。有:纖維素Sephacel、交聯(lián)葡聚糖Sephadex交聯(lián)瓊脂糖Sepharose2/4/2023311)纖維素Sephacel離子交換劑基本結(jié)構(gòu):以微晶纖維素為基質(zhì),化學(xué)方法引入電荷基團(tuán),構(gòu)成各種陽(yáng)離子、陰離子交換劑;示弱陰離子樹(shù)脂的結(jié)構(gòu)(DEAE-Sephacel)BeadedCellulose-O-CH2-CH2N+-H-Cl-CH2CH3CH2CH32/4/2023322/4/2023海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss332)交聯(lián)葡聚糖Sephadex離子交換劑以交聯(lián)葡聚糖G-25和G-50為基質(zhì),化學(xué)法引入電荷基團(tuán)構(gòu)成各種陰離子、陽(yáng)離子交換劑。(DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex)。DEAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-QAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-CH2-CH(OH)-CH3-Cl-CH2CH3CH2CH3CH2CH3CH2CH32/4/2023342/4/2023海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss353)瓊脂糖Sepharose離子交換劑以交聯(lián)瓊脂糖CL-6B為基質(zhì),化學(xué)法引入電荷基團(tuán)構(gòu)成陽(yáng)離子交換劑CM-SepharoseCL-6B和陰離子交換劑DEAE-SepharoseCL-6B。CM(SepharoseCl-6B)-O-CH2-C-02Na+DEAE-SepharoseCl-6B-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-CH2-CH3CH2-CH32/4/202336親水性離子交換劑的結(jié)構(gòu)瓊脂糖離子交換劑的基本結(jié)構(gòu)以交聯(lián)瓊脂糖CL-6BSepharose為基質(zhì)。其網(wǎng)孔的大小通過(guò)交聯(lián)劑的比例調(diào)節(jié),適合分離各種不同分子量的物質(zhì)。2/4/202337ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity19952/4/202338二、離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度3.吸水量或膨脹度4.交換容量5.穩(wěn)定性6.比重7.流速2/4/202339離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度:離子交換劑的基質(zhì)的交聯(lián)度根據(jù)適用的要求,調(diào)節(jié)交聯(lián)劑在基質(zhì)中的比例或百分濃度而制成各種(篩孔)型號(hào)的交換劑。3.吸水量與膨脹度:是指離子交換劑在水溶液中吸取的體積,即篩孔中所占的體積(Vi)。吸水量與膨脹度受基質(zhì)的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、電荷基團(tuán)及交聯(lián)度的影響。4.交換容量:離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。2/4/202340離子交換劑的膨脹度與離子強(qiáng)度的關(guān)系1)在相同離子強(qiáng)度的條件時(shí),膨脹度隨著基質(zhì)的交聯(lián)度的增加而降低。2)在相同離子強(qiáng)度的條件時(shí),強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型的離子交換劑的膨脹度大,弱酸、弱堿的膨脹度小。說(shuō)明前者的解離度達(dá)最大,帶電荷基團(tuán)之間的排斥力大,結(jié)果膨脹度亦大。2/4/202341pH對(duì)離子交換劑膨脹度的影響弱陽(yáng)離子交換劑的膨脹度隨著pH的增高而增大弱陰離子交換劑的膨脹度隨著pH的降低而增大弱離子交換劑在其近pK值時(shí)的pH中膨脹度最小交聯(lián)度大的或帶強(qiáng)電荷基團(tuán)的離子交換劑,其膨脹度基本與pH的變化無(wú)關(guān)2/4/202342離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度:離子交換劑的基質(zhì)的交聯(lián)度根據(jù)適用的要求,調(diào)節(jié)交聯(lián)劑在基質(zhì)中的比例或百分濃度而制成各種(篩孔)型號(hào)的交換劑。3.吸水量與膨脹度:是指離子交換劑在水溶液中吸取的體積,即篩孔中所占的體積(Vi)。吸水量與膨脹度受基質(zhì)的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、電荷基團(tuán)及交聯(lián)度的影響。4.交換容量:離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。2/4/202343交換容量的影響因素篩孔:篩孔的直徑與分離物的分子量大小密切相關(guān)。(表P76)離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度的增加引起對(duì)交換劑上結(jié)合蛋白質(zhì)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng),而降低交換容量,在解離中便利用逐漸加大離子強(qiáng)度的原理。2/4/202344pH與交換容量的關(guān)系弱陰離子交換劑的交換容量是隨著pH的下降而增大弱陽(yáng)離子交換劑的交換容量是隨著pH的上升而增大強(qiáng)陰離子與強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑的交換容量基本與pH變化無(wú)關(guān),因其完全呈解離狀態(tài),始終很高2/4/202345交換容量的影響因素若加樣量超過(guò)樹(shù)脂的容量,寶貴的活性會(huì)隨著未吸附的物料一起流失;若樹(shù)脂過(guò)量,會(huì)大大減少活性物質(zhì)的回收。測(cè)定實(shí)驗(yàn):2/4/202346注意交換容量包含樣品中的總蛋白量,而非僅僅是活性蛋白。各種蛋白樣品與樹(shù)脂的交換容量是不同的,應(yīng)分別測(cè)定。放大實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)適當(dāng)留一定的結(jié)合空間,并使之在最小量。2/4/202347最佳上樣pH的選擇pH5.05.56.06.57.09.0+SSSSSS4℃,30~60min搖勻,充分結(jié)合+++++++
------
在低的pH時(shí),蛋白質(zhì)未結(jié)合,上清有活性,隨著pH的上升,蛋白質(zhì)與樹(shù)脂結(jié)合愈多,直至完全結(jié)合,上清中再檢測(cè)不到活性。+-離心,檢測(cè)上清的活性最佳上樣時(shí)高于緩沖液一個(gè)pH2/4/2023485穩(wěn)定性:都具有理化穩(wěn)定性。6比重:7流速:2/4/202349內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類(lèi)與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2/4/202350第三節(jié)操作一、離子交換劑的選擇、處理與轉(zhuǎn)型二、緩沖液的選擇三、分離物質(zhì)的交換四、程序2/4/202351一、離子交換劑的選擇、處理與轉(zhuǎn)型被分離物質(zhì)帶正電荷,選擇陽(yáng)離子交換劑;被分離物質(zhì)帶負(fù)電荷,選擇陰離子交換劑;被分離物質(zhì)為兩性離子,依據(jù)其在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)所帶電荷選擇交換劑。陰離子交換劑結(jié)合帶陽(yáng)離子交換劑結(jié)合帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)正電荷的蛋白質(zhì)2/4/202352①對(duì)于已知pI的物質(zhì):在高于其等電點(diǎn)的pH,用陰離子交換劑;在低于其等電點(diǎn)的pH,用陽(yáng)離子交換劑。②對(duì)于未知pI的物質(zhì):可參照電泳的結(jié)果,在中性或偏堿性的條件下進(jìn)行電泳,向陽(yáng)極移動(dòng)較快的物質(zhì),在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附;向陰極移動(dòng)或向陽(yáng)極移動(dòng)較慢的,可被陽(yáng)離子交換劑吸附。2/4/202353離子交換劑的選擇的原則★分離生物大分子一般采用親水性基質(zhì)。具有可人工控制的分子篩,及較多的可交換的基團(tuán);★分離酶、核酸、蛋白質(zhì)等采用弱性的離子交換劑。其交換容量大,親水性,對(duì)生物樣品的穩(wěn)定性好,易發(fā)生結(jié)合;★洗脫液的pH與被分離物的pI至少相差一個(gè)pH值,才能將各種成份分開(kāi)。pH﹥pI一個(gè)單位時(shí)選擇陰離子交換劑;pH﹤pI一個(gè)單位時(shí)選擇陽(yáng)離子交換劑。2/4/202354離子交換劑的選擇的原則例:。pI=5.2的物質(zhì)在不同的pH條件下帶電荷性質(zhì)、帶凈電荷量不同,而能分別與陽(yáng)離子、陰離子交換劑結(jié)合。實(shí)驗(yàn)上選擇陰離子,因?yàn)閺膒H6.2-8.5條件溫和。不影響生物樣品活性;選擇陽(yáng)離子時(shí),pH從4.2-3.0,條件極端,可能使樣品失去活性。2/4/2023552.離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型目的:要求其帶上使用時(shí)所期望的離子或基團(tuán)。處理步驟:先用水浸泡至充分膨脹即可進(jìn)行處理。除細(xì)顆粒酸堿浸泡水洗滌堿或酸處理水洗滌緩沖液平衡再生:通過(guò)酸堿反復(fù)處理或借助轉(zhuǎn)型處理完成。轉(zhuǎn)型:指離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過(guò)程,轉(zhuǎn)型后的離子交換劑會(huì)按使用要求帶上一定種類(lèi)的離子或基團(tuán)。除雜質(zhì):P84表5-92/4/202356為什么金屬離子(Na+、K+等)可以吸附在H-型強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱上,而后又可以用HCl來(lái)再生強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱?
親和力大小不僅與離子性質(zhì)有關(guān),而且與其濃度有關(guān)。前者根據(jù)一價(jià)金屬離子的親和力順序不難理解,而后者是采用高濃度HCl來(lái)再生強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱。2/4/202357二、緩沖液的選擇離子交換劑吸附被分離物的量與緩沖液的pH值和離子濃度有密切關(guān)系。起始緩沖液:pH值一般比有效成分的pI值高一個(gè)單位或低一個(gè)單位,離子強(qiáng)度為0.1。洗脫液:離子強(qiáng)度和pH值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來(lái)。一般離子強(qiáng)度要比起始緩沖液高,pH值是隨著離子交換劑性質(zhì)變化而變化。2/4/202358三、交換動(dòng)態(tài)法---柱層析法:交換效率高,應(yīng)用廣泛。適合于制備、純化及分析。適用于實(shí)驗(yàn)室、科研,教學(xué)以及模型的建立;靜態(tài)法---可以大容器:盆、缸、桶、罐等操作。樣品液與交換劑進(jìn)行混合、攪拌、吸附,濾去上清液,再解吸附,濃縮。適合工廠,生產(chǎn)車(chē)間,產(chǎn)品的中試。其操作方便,設(shè)備簡(jiǎn)陋,快速定性等優(yōu)勢(shì)。2/4/202359四、程序填裝柱子柱子平衡加入樣品開(kāi)始洗脫分步收集定性檢測(cè)合并峰值濃縮樣品除去鹽離子定量分析計(jì)算回收率及純化倍數(shù)再生2/4/202360離子交換劑層析裝置(梯度洗脫配置)2/4/2023611.裝柱與加樣量樣品的準(zhǔn)備樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度,可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過(guò)濾前以離心法除去。2.洗脫原則:增加離子強(qiáng)度、改變pH值方式:梯度洗脫(Gradientelution)階段洗脫(Stepwiseelution)2/4/202362
2/4/202363離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫曲線p86鹽濃度吸收曲線2/4/202364離子強(qiáng)度非線性梯度(階梯式洗脫曲線)2/4/202365影響梯度洗脫速率變化的因素A:當(dāng)CA、CB的濃度確定后,總體積V越小,梯度速率變化越快。ABB:當(dāng)體積V確定時(shí),CB-CA差值越大,梯度速率變化越快。0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1Vt1Vt22/4/202366比較線性梯度與階梯式梯度洗脫顯示:在樣品組分、柱子規(guī)格、緩沖液成份、洗脫速度相似的條件時(shí),其分辨率有差異。但并未表現(xiàn)明顯優(yōu)勢(shì)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),當(dāng)分離物各組分差異較小時(shí),選用線性梯度;差異較大則選用階梯式梯度,以減小體積和節(jié)省時(shí)間。2/4/202367A.C.相同條件的線性梯度
A.流速8毫升/小時(shí),C為20毫升/小時(shí);
B與A的流速相同,離子梯度不同
結(jié)果:三者顯示分辨率不同的結(jié)果線性梯度、洗脫速度與分辨率2/4/202368梯度圖的分析當(dāng)緩沖液的pH﹥pI(樣品)時(shí),樣品帶負(fù)電荷,結(jié)合到陰離子交換劑,解吸附時(shí),將pH下降,越來(lái)越靠近pI,直至其pI、甚至pH﹤pI,樣品電荷由-0+。樣品解離。A為陰離子交換劑。pH從10-7.5,變化。當(dāng)緩沖液的pH﹤pI(樣品)時(shí),樣品帶正電荷,結(jié)合到陽(yáng)離子交換劑,解吸附時(shí),將pH上升,越來(lái)越靠近pI,直至其pI、甚至pH﹥pI,樣品電荷由+0-。樣品解離。B為陽(yáng)離子交換劑。pH從4.5-8.9變化。AB2/4/202369內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類(lèi)與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2/4/202370去離子水的制備自來(lái)水過(guò)濾R-SO3H柱RN(CH3)3OH柱去離子水混合柱RN(CH3)3OH柱1.水處理2/4/202371交換柱的填充樹(shù)脂一般采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂,如001×7(732#)和201×7(717#);由于交換容量不同,實(shí)驗(yàn)中通常采用一根陽(yáng)離子交換柱和二根陰離子交換柱?;旌现矐?yīng)按等交換容量比例混合;混合柱的作用:由于離子交換是可逆反應(yīng),經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換柱和陰離子交換柱處理的去離子水,還存在著微量未交換的離子。若讓它再通過(guò)混合柱,由于兩種交換過(guò)程同時(shí)進(jìn)行,離子交換后生成的H+和OH?結(jié)合成水而除去,進(jìn)一步提高了水的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)室精制去離子水可采用
5cm×100cm混合柱處理一次去離子水。2/4/2023722.分離純化小分子物質(zhì)
離子交換層析廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。2/4/202373核苷酸的解離性質(zhì)(pK)核苷酸磷酸基一級(jí)解離氨基磷酸基二級(jí)解離pIAMP0.93.76.22.35GMP0.72.46.11.55CMP0.84.56.32.66UMP1.0__6.4__見(jiàn)圖P88的分離圖譜2/4/2023743.分離純化生物大分子物質(zhì)
離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來(lái)進(jìn)行分離純化的,是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。用離子交換層析制備、純化電荷量不同的生命物質(zhì)時(shí),不但被分離物的活性可以保存,而且分辨率較高。2/4/202375各蛋白質(zhì)樣品的等電點(diǎn)BSApI=4.7糜蛋白酶pI=8.8胰蛋白酶pI=8.1細(xì)胞色素CpI=9.8~10.12/4/2023764.測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pH
活力單位5678pH梯度變化,間隔0.2單位。檢測(cè)每管的活力單位。確定該酶的等電點(diǎn)。2/4/202377pI=5.3陽(yáng)離子交換劑05.05.58.0活性陰離子pH8.0--pH6.5--pH5.5-+pH5.0+pH4.5++pH4.0+++不吸附,上清有活性吸附,上清無(wú)活性陽(yáng)離子pH8.0---pH6.5--pH5.5+—pH5.0—pH4.5++pH4.0+++不吸附,上清有活性吸附,上清無(wú)活性用陽(yáng)離子時(shí),活性出現(xiàn)在高pH的上清中;用陰離子時(shí),活性出現(xiàn)在低pH的上清中。陰離子交換劑2/4/202378小節(jié)進(jìn)行離子交換的蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)條件下必須有單一電荷。溶液中單一電荷的蛋白質(zhì)可被離子交換劑樹(shù)脂上的小離子交換,固定在樹(shù)脂上;通過(guò)增加溶液中反離子濃度或降低蛋白質(zhì)所帶電荷量等方法可將蛋白質(zhì)從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是離子交換劑層析的重要依據(jù)。進(jìn)行離子交換層析的最佳溶液pH值一般與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差一個(gè)單位;使蛋白質(zhì)的靜電荷量即可保證結(jié)合在離子交換劑上,又利于洗脫與分離。交換樹(shù)脂的選擇:被分離物質(zhì)帶正電荷,選擇陽(yáng)離子交換劑,被分離物質(zhì)帶負(fù)電荷,選擇陰離子交換劑;被分離物質(zhì)為兩性離子,依據(jù)其在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)所帶電荷選擇交換劑。2/4/202379樹(shù)脂的溶脹(膨脹)與pH、離子強(qiáng)度、與交換容量的關(guān)系。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2024年道路運(yùn)輸服務(wù)項(xiàng)目資金籌措計(jì)劃書(shū)代可行性研究報(bào)告
- 2023年汽、柴油深度加氫催化劑投資申請(qǐng)報(bào)告
- 2024年煙度計(jì)項(xiàng)目投資申請(qǐng)報(bào)告代可行性研究報(bào)告
- 十字相乘法課件
- 《故事口才故事會(huì)》課件
- 消防知識(shí)國(guó)旗下講話稿(33篇)
- 門(mén)面房租賃合約合同(31篇)
- 社區(qū)環(huán)境調(diào)查報(bào)告
- 四川省遂寧市蓬溪縣2024屆九年級(jí)上學(xué)期期末考試數(shù)學(xué)試卷(含答案)
- 貴州省六盤(pán)水市2023-2024學(xué)年高二上學(xué)期1月期末質(zhì)量監(jiān)測(cè)試題 數(shù)學(xué) 含答案
- 精神科護(hù)士年終總結(jié)個(gè)人2024
- 北京2024年北京市疾病預(yù)防控制中心面向應(yīng)屆生招聘38人筆試歷年典型考題及考點(diǎn)附答案解析
- 八年級(jí)英語(yǔ)下教研工作計(jì)劃5篇
- 超市供貨服務(wù)方案(2篇)
- 健康管理實(shí)務(wù)考試題及答案
- JT-T-1198-2018公路交通噪聲防護(hù)措施分類(lèi)及技術(shù)要求
- 馬克思主義發(fā)展史智慧樹(shù)知到期末考試答案章節(jié)答案2024年廣西師范大學(xué)
- 中國(guó)特色社會(huì)主義事業(yè)的總體布局與五位一體發(fā)展戰(zhàn)略
- 教科版小學(xué)二年級(jí)上冊(cè)科學(xué)期末測(cè)試卷附參考答案(滿分必刷)
- 2024-2030年中國(guó)廚余垃圾處理機(jī)行業(yè)市場(chǎng)全景調(diào)研及前景戰(zhàn)略研判報(bào)告
- 運(yùn)動(dòng)生物力學(xué)智慧樹(shù)知到期末考試答案章節(jié)答案2024年山東體育學(xué)院
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論