【報告】紙層析法分離氨基酸實驗報告

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紙層析法分別氨基酸一、前言紙層析法紙層析法又稱紙色譜法，是目前廣泛應(yīng)用的一種分別技術(shù)。本世紀(jì)初俄國植物學(xué)家M.Tswett覺察并使用這一技術(shù)證明白植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素移動距離(Rf值)用適宜方法定量(如光度法、比色法等)。紙層析法(paperchromatography)于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定;也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流淌相。3，4-GC、HPLC應(yīng)用普遍。做葉綠體色素分別時用到,將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液(石油醚)混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對含量和種類。ab反之則慢;含量較多者色素帶也較寬。最終在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法能清楚地將葉綠體中的色素分別。氨基酸2l世紀(jì)全球的主要產(chǎn)業(yè)之一，氨基酸的需求量越來越大，1008002060年月起，氨基酸的應(yīng)用在食品工業(yè)占61,，在飲料工業(yè)占30,，醫(yī)藥、日用化工、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)保、輕工、生物工程技術(shù)等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人類生活的很多方面都有著應(yīng)用:在食品德業(yè)的應(yīng)用在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用在飼料添加劑行業(yè)的應(yīng)用在化裝品德業(yè)的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用在其他行業(yè)的應(yīng)用氨基酸工業(yè)還有著寬闊的進(jìn)展前景:傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)方法運用基因工程手段生產(chǎn)氨基酸大力進(jìn)展藥用中間體,具體為:①氨基酸及其衍生物漸漸成為藥用中間體②非自然氨基酸是合成活性藥物的重要原料③生產(chǎn)高附加值的非自然氨基酸二、試驗?zāi)康陌盐瞻才艑游龅脑?，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)(包括點樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量)。學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分(水解、層析及鑒定)分析的方法。三、試驗原理紙層析是以濾紙為惰性支持物的安排層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層分別。溶質(zhì)在濾紙上的移動速度用比移值Rf值表示：Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的構(gòu)造、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本試驗利用紙層析法分別氨基酸。四、試驗試劑和器材試驗試劑：氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。2.80%甲酸氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/mL)正丁醇試驗器材：華濾紙培育皿電熱鼓風(fēng)枯燥箱吹風(fēng)機毛細(xì)管針、線、尺。鐘罩(430mm,290mm，具磨口塞)五、操作步驟標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析單向上行層析Rf值的測定濾紙：選用國產(chǎn)華1號濾紙，6cm×7cm2cm處劃線，用鉛筆在線上標(biāo)上四個點作為點樣位子〔留出縫線空間〕。點樣：清；中心，這時樣品就自動流出；0.5cm樣品干后再點其次滴，為使樣品加速枯燥，可用吹風(fēng)機吹干，但要留意溫度不行過高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果；④將點好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。留意縫線而造成溶劑前沿不齊，影響Rf1cm劑前沿位置。65℃10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點。RfRf3Rf80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮2ml25℃，1h。六、試驗結(jié)果亮氨酸甘氨酸脯氨酸待測氨基酸原點到層析斑點中6.052.903.492.61心的距離3.746.47原點到溶劑前沿的距離7.247.247.247.24Rf0.840.400.480.360.520.89推斷待測氨基酸推斷待測氨基酸亮氨酸甘氨酸脯氨酸甘氨酸脯氨酸亮氨酸理論Rf0.790.300.48七、留意事項點樣過程中必需在第一滴樣品干后再點其次滴；以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果；將揉成圓筒狀的濾紙放入培育皿內(nèi)時，留意濾紙不要碰皿壁；使用的溶劑系統(tǒng)需穎配制，并要搖勻；清；析紙，由于手上常常有少量含氮物質(zhì)。顯色時它也呈現(xiàn)紫色斑點。污中的氨；展層開放時切勿是樣品點浸入溶劑中。八、思考題統(tǒng)？Nernst1891的濃度比為一，即(Kd)。Kd=Ca/CbCaCbA相和B質(zhì)在A和B何影響?答：酸性溶液中，有利于氨基酸的堿式電離，氨基結(jié)合質(zhì)子，整個分子帶正電荷；反之，堿性溶液中有利于羧基的酸式電離，氨基酸分子整體帶負(fù)電荷。酸性溶劑系統(tǒng)(或堿性溶劑系統(tǒng))對堿性氨基酸(賴、精、組)RfRf值增大。反之，堿性性溶Rf值增大。什么是安排系數(shù)？答：安排系數(shù)是指肯定溫度下，處于平衡狀態(tài)時，組分在固定相中的濃度和在流淌相中的濃度之比，以K九、爭論利用紙層析法分別氨基酸的具體流程及方法，并且了解了其工作原理，這對于以后的學(xué)習(xí)是有很大幫助的。經(jīng)查閱資料得，亮氨酸的理論Rf0.79〔酸相〕，脯氨酸的理論Rf0.48〔酸相〕，甘氨酸的理論Rf0.30〔酸相〕。通過比對濾紙上單一氨基酸層析位置、計算出其試驗Rf了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸這三種氨基酸?？傮w來講，本次試驗三種氨基酸試驗Rf得出幾點影響試驗結(jié)果的因素，如下：點樣過程中未在第一滴樣品干后再點其次滴；雖用玻璃罩將濾紙罩住，但還是會有些許空氣中的氨在其中，影響試驗結(jié)果；將揉成圓筒狀的濾紙放入培育皿內(nèi)時，濾紙不留神觸遇到皿壁，消滅虹吸現(xiàn)象；使用穎配制的溶劑系統(tǒng)時，并未完全搖勻；析紙，由于手上常常有少量含氮物質(zhì)。顯色時它也呈現(xiàn)紫色斑點。污并未戴橡皮手套或指套，在制作濾紙筒時手不留神觸