體內藥物分析

綴合物：綴合物類型：①葡萄糖醛酸苷：含-OH、-COOH、-NH2、-H等功能團的成分可與葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物②硫酸酯：芳胺、酚類及醇類成分可與硫酸形成硫酸酯綴合物血漿蛋白結合率：反映了藥物與血漿蛋白的親和程度。一般指在治療量時藥物結合的百分率，作為藥代動力學的重要參數(shù)之一，影響了藥物在體內的分布、代謝、排泄，與藥物的藥理作用強度密切相關。一相代謝：氧化、還原、水解反應。在藥物結構中引入羥基、羧基、氨基等官能團，為二相代謝做準備二相代謝：結合反應。具有羥基、羧基、氨基等官能團的藥物與糖、硫酸鹽、氨基酸等結合，極性增大，利于排肝內代謝反應類型：以氧化為主，其次為還原、水解結合腸內菌的生物轉化：利用腸內菌微生物中特定酶將中藥成分（或天然化合物）進行生物轉化，屬單酶或雙酶的高密度轉化。具有高度選擇性（尤其是立體選擇性）和反應條件溫和的特點。以水解反應為主，其次為氧化還原反應。?蛋白質的去除：沉淀法（有機溶劑沉淀法、鹽析法、酸性試劑沉淀法、加熱沉淀法）；酶消化法；超濾法、透析法、微孔濾膜過濾法。?影響液相提取的因素：提取溶劑；水相PH值（根據(jù)待測成分PKa；為保證提取率的重現(xiàn)性，常使用緩沖溶液）；離子強度（越大提取率越高）?影響固相提取的因素：合適的洗滌劑和洗脫劑；流速（不宜過快）；上樣量（樣品突破性實驗可判斷上樣量是否超載）?固相提取的操作步驟：固相柱選擇、處理一樣品上樣一分離純化一洗脫待測成分一濃縮處理或直接進樣分析?檢測限和定量限LOD&LOQ的確定和要求：LOQ【能從背景信號中區(qū)分出藥物時所需樣品中藥物的最低濃度】可于空白生物基質加入定量的藥物標準品混勻，配制成藥濃在標準曲線末端并逐漸降低的一組藥品，然后對每種濃度測定3?5次，以測定結果的精密度達到W20%和準確度達到W+20%時的樣品中藥物的最低濃度。LOD【保證具有一定可靠性前提下，分析方法能測定出樣品中藥物最低濃度】-測定時記錄各濃度樣品每次測定得到的藥物信號強度S與噪音/背景信號強度N,然后取均值S、N,以能達到S/N=3時樣品藥濃為LOD。?提取回收率的操作與要求：往空白生物基質或含藥物的樣品中加入的藥物標準品已知量A,實際上是準確加入已知濃度的藥物標準品溶液一定體積，使兩種考核樣品內含總藥濃應包括高、中、低三種（濃度接近最高、平均、最低藥濃）。每個濃度應測定多次（3?5），并且?guī)状螠y定值M的相對標準差應符合“內標法中內標物回收率與待測物不相差10%”的要求，然后取均值M?透析法影響因素：透析膜對藥物的吸附；donnan效應；緩沖液體積變化。分析常用生物樣品的種類和特點a?血樣①常用于藥代動力學、生物利用度、血藥濃度檢測②包括全血、血漿和血清，其中血漿和血清常用③全血加抗凝劑，離心后分取上清液得到血漿④全血在纖維蛋白原等作用下引起血塊凝結析出，離心后取上清液得到血清⑤常用抗凝劑有肝素、鈣結合劑EDTA、枸緣酸鈉、草酸鉀、氟化鈉等。常用肝素⑥制備血清時血塊凝結，易造成成分吸附損失⑦抗凝劑的選擇可影響測定結果b?尿液①常用于成分代謝研究②尿液樣品量大，待測成分濃度高、變化較大、與血液的成分濃度相關性不強⑤短時間內不可能多次取樣，不易采集完全c?唾液①可用于藥代動力學和藥物濃度監(jiān)測②唾液中成分濃度通常與血漿濃度相關。一般低于血漿濃度且變化較大，但二者存在恒定的比例關系③采集不受地點、時間限制，易獲得④許多用于血漿測定的方法稍加改進即可用于唾液測定⑥組成受各種因素影響較大，且個體差異較大d?臟器①用于研究成分在各器官、組織的分布、積蓄或代謝情況②臟器組織可與成分形成強烈結合③在分離分析前，需預先制成1:5或1:10的勻漿，以提高溶劑抽提率，降低組織空白值，避免乳化2?體內分析常用生物樣品的采集和貯存方法；采集：必須有代表性，應力求取樣條件標準化，包括攝取標準膳食，控制飲水量等。保存：①血漿、血清：盡快從全血中分離，一般不超過24小時，冷凍貯存②尿液：采樣后立即加入防腐劑（甲苯、氯仿）室溫保存或冷凍貯存③臟器組織：-20°C冷凍3?生物樣品的常用保存方法：冷凍貯存①短時間內分析的樣品，4C冷藏②放置數(shù)日或更長時間的樣品-20C③冷凍樣品測定時，須臨用前解凍，并在解凍后一次性測定完畢，不宜反復冷凍解凍，否則會導致成分含量下降；B.加穩(wěn)定劑①加入酶活性阻斷劑：氟化鈉（常用，可抑制血清酯酶，并抗凝防腐）四氫尿苷、三氯酸鈉②加抗氧劑VC；C.加防腐劑：尿液中加甲苯（每100ml尿液加1ml充分振蕩混勻或加在尿液表面形成薄層）、氯仿（加少許搖勻使其飽和，瓶底留少量氯仿）等；D.調pH值：加無機酸或碳酸鈉改變尿液酸堿度，可抑制細菌生長5?體內分析方法設計思路和建立步驟、評價指標和方法。研究思路：①樣品：中藥水煎劑②實驗動物：犬豬③給藥途徑：口服④含藥血清：不同時間點含藥血清（時效曲線）血清藥理學研究（藥效機理）⑤相關分析：體內直接物質接觸，原型成分，代謝產(chǎn)物藥物分析方法評價指標：準確度、精密度、檢測限和定量限、專屬性、藥物穩(wěn)定性、標準曲線、重復性、耐用性、樣品測定（QC樣品）1?準確度：A.回收率⑴提?。ㄝ腿?絕對）回收率測定方法①對比法②標準曲線法；⑵相對回收率：回收試驗法、加樣回收試驗法。2?精密度：（測定結果與平均值的偏離程度）將分析后剩余樣品混合成含藥濃高中低三種，測定時對每種重復測定3-5次，并且每次應從取樣開始至測定完成后得到的結果。將得到的測定值分別算出高中低三種藥濃樣品測定結果標準差和相對標準差RSD。3?靈敏度：【LOD+LOQ】光譜分析和免疫分析可測定4-5份空白生物樣品的信號強度（光吸收度，熒光強度或放射性強度）以均值作為N,色譜分析可用空白樣品按樣品分析方法制備的溶液進樣，記錄空白色譜圖。取相當于藥物峰寬W20倍的一段基線，且范圍應相當于藥物峰最后一段，實際測定時刻增加記錄儀靈敏度，放大此段基線，然后以偏離基線平均噪音水平最大峰高的一半作噪音值，且應重復幾次，用得到的均值N計算信/噪比S/N4?專屬性5?線性與范圍：標準濃度應包括一定梯度的5-8個濃度（等比關系，非線性者如免疫分析可適當增加），每個濃度只需測定一次（免疫分析可測定兩次并取平均）。一般濃度上限為樣品最高濃度的120%，下限為樣品最低濃度的80%但高于LOQ。在舍棄點時，應從兩段舍，保證r合格（r>0.99,制劑分析HPLC：r>0.999）?專屬性specificity的操作與要求：1.生物基質的影響【要求】：可取3個以上不同個體的空白樣品，考察正常生理情況下樣品中生物基質的影響。色譜分析：要求藥物與內標峰附近無干擾峰；光譜分析：要求藥物測定波長處無雜質吸收（或無雜質熒光）；免疫分析：應比較同量藥物加入空白體液和緩沖液中測值的差異，并盡量用參比方法（如色譜法）作對比。2.藥物代謝物的影響3.配伍藥物的影響4.參比方法對照【操作】：一般選用專屬性強，準確度高的色譜法進行對照。在對照比較時，通常是將同一批含藥濃度不同的藥品，用待考察方法測得濃度為縱坐標y,參比方法為x，并且坐標標度相同，如此做成相關性圖?；貧w方程為Y=a+bX,其中b表示測定結果相關性。等同線Y=bX（b=l）為等同線線性方程，表示兩方法測定結果完全相等。若回歸線越接近等同線，則待考察方法越接近參比方法；若b越接近1（a很小時），則考察方法越等同于參比方法。體內藥物分析：體液藥物分析、生物藥物分析，滿足臨床藥學、臨床藥理學的發(fā)展和需要，通過各種分析手段，了解藥物的體內過程藥物代謝：藥物吸收和分布之后在血液或組織中的生物轉化過程。是溝通藥物化學和藥理學的橋梁。代謝產(chǎn)物：生物轉化的產(chǎn)物。生物轉化：藥物在生物體內的化學反應質控樣品：于空白生物基質中加入不同濃度的藥物標準溶液，配置成含藥物高中低三種已知濃度的QC樣品，并在穩(wěn)定條件下貯存。每個濃度應測定兩次，要求得到6個測定值中至少4個落在已知濃度的±20%范圍內，以此作為判斷本次樣品分析合格的標準中藥成分體內分析意義（一） 進行中藥血清化學和血清藥理學研究，闡明中藥體內直接物質基礎及其作用機制的重要技術基礎。中藥學清化學和中藥學清藥理學為中藥體內代謝研究的發(fā)展奠定了基礎。中藥體內代謝研究的發(fā)展為中藥血清華夏和中藥血清藥理學的研究內容提出了更高的要求。三者相輔相成將會對中藥作用物質基礎復雜性和作用機制復雜性的闡明提供關鍵的科學依據(jù)和方法、手段，為中藥現(xiàn)代化研究提供開拓性思維和方法。（二） 中藥成分生物轉化和代謝研究是新藥設計發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新的重要途徑。①吸收不良導致新藥開發(fā)失敗或成本增加②腸內菌對藥物結構的生物轉化、肝臟藥物代謝酶對藥物結構的修飾導致藥物失效④不良的藥代動力學參數(shù)、生物轉化或代謝產(chǎn)物產(chǎn)生毒性導致新藥開發(fā)失敗⑥藥物代謝酶基因多態(tài)性導致藥物效果的個體偏差和應用受限?合理的藥物設計應該充分考慮藥物代謝途徑及相關代謝特征，找出先導化合物的代謝hotspot通過對藥物生物轉化或代謝的有益發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)對先導藥物的化學結構改造，以改善藥理作用，提高療效，降低毒性或增加穩(wěn)定性①體內不代謝或僅經(jīng)水解酶代謝的新藥設計②對藥物分子進行結構修飾以防止其失活的新藥設計③合成有效代謝物或模擬有效代謝物結構的新藥設計④仿生藥物轉化的新藥設計⑤據(jù)肝臟細胞色素P450代謝特點的新藥設計?從天然藥物生物轉化和代謝產(chǎn)物中篩選新藥更有利于新藥的源頭性創(chuàng)新其理想程序為：中藥-人種藥理學為先導-先導化合物-物理化學性質-體外ADME-體內ADME-毒性評價-可接受先導化合物-候選藥物-創(chuàng)始性藥物天然組合化合物庫/組合代謝產(chǎn)物庫-高通量篩選-活性再評價（三）藥物評價的重要內容和技術基礎：藥代動力學、生物利用度、安全性（四）臨床藥學和臨床藥理學賴以建立和發(fā)展的技術基礎和實驗手段特點：干擾雜質多，樣品量少濃度低，不穩(wěn)定性，要求快速提供結果第一節(jié)中藥成分在生物體內的存在狀態(tài)一、 藥物體內過程：吸收一血漿（D+P—DP藥物-蛋白復合物）、受體（作用部位：R+DoRD）、組織（貯存：D+ToDT）生物轉化（D+E藥物代謝酶oM代謝物）一排泄二、 中藥成分體內存在狀態(tài)包括原型成分，原型成分經(jīng)生物轉化生成的代謝產(chǎn)物，以及二者與生物大分子（如蛋白質、受體）的結合物。在血液中只有未同蛋白質結合的游離藥物才可以從血液自由的透過細胞膜，到達作用部位而發(fā)揮療效。藥物與蛋白質的結合能減慢藥物從循環(huán)血液中的消失，起到藥物庫的作用。三、 藥物與血漿蛋白的結合藥物通過體液輸送到器官、組織，在體內轉運、轉化過程中，可與組織蛋白（包括受體）和體液蛋白結合。因此研究藥物與體液蛋白的結合非常重要。在常見的體液樣品中，血漿、血清富含血漿蛋白。由于血漿、血清主要生化成分相近。二者均可作為分析樣品并常常能互相代替。D藥物+P血漿蛋白oDP藥物-蛋白復合物：藥物主要與白蛋白（清蛋白，血漿主要蛋白質，占總量的一半）結合，極性小的脂溶性藥物可與脂蛋白結合可逆性：藥物與血漿蛋白的結合主要通過非共價鍵力，即依靠分子鍵氫鍵、范德華力等。因此是可逆過程，離解速度很快;非特異性：血漿蛋白能和很多藥物結合，多數(shù)酸性藥物與血漿白蛋白結合，堿性藥物除與白蛋白結合外，還能和酸性糖蛋白結合;競爭性：兩個藥物競爭血漿蛋白的同一結合部位，結合率高的可置換出結合律低的藥物；藥物的代謝產(chǎn)物也能競爭性取代與蛋白結合的母體藥物。另一方面，部分藥物也可以促進血漿蛋白對另一藥物的親和力四、 血漿蛋白結合率及其測定結合平衡后，血漿中藥物總濃度（C總）分為兩部分：與血漿蛋白結合濃度（C結合）和游離血藥濃度（C游）蛋白結合率=C結合/C總=（C總-C游）/C總（一）透析法：將血清置于透析管中，懸于含藥物的緩沖液中，在一定溫度下靜置或持續(xù)震蕩數(shù)小時，達到平衡后，透析管內外游離型藥物濃度相等，而管內除含有游離型藥物外，還保留了藥物與蛋白質的結合物（結合型藥物）計算：測定管外溶液中藥物濃度（游離藥物濃度）和管內藥物總濃度，兩者之差即為與血漿蛋白結合的藥物量。由此可計算出被測藥物的血漿蛋白結合率。蛋白結合率=（管內藥物濃度-管外）/管內注意：1?透析膜①型號選擇：由醋酸纖維素制成，應根據(jù)截留分子量的大小選擇。②檢漏：加3%CC13COOH是否有沉淀③保存方法：新的干燥透析膜應保存在密封的聚乙烯袋中，以防止受潮生霉。濕的用1%苯甲酸鈉或0.05%疊氮化鈉溶液防腐5°C保存。經(jīng)處理或使用的透析膜不允許其再次干燥，應保存在50%甘油或乙醇中。2?預處理：①透析膜通常含10%水25%甘油0.1%硫化物。一般透析時只要浸泡潤濕并用蒸餾水充分洗滌，即可使用②硫化物去除：用10mmol/L碳酸氫鈉浸洗，用50%乙醇浸泡或煮沸③微量重金屬去除：10mmol/L的EDTA浸泡蛋白質溶液：多用人或動物的血漿，也可用白蛋白。一般用牛血紅蛋白3?緩沖溶液：磷酸鹽緩沖液（pH=7.4-7.5）濃度0.1-0.2mol/L當藥物含有羧基或酚羥基時，磷酸鹽緩沖液濃度不能太高或太低，一般應加入適量中性鹽，如0.15mol/L氯化鈉4?平衡溫度與時間：常用37°C/4°C/20°C,為縮短平衡時間，可采用震蕩平衡法，必要時需加適量防腐劑。平衡確定方法：取與血漿樣品液相同體積的透析液，放入另一只透析管中作對照，確定藥物管內外自由擴散達到平衡的時間5.影響因素①透析膜對藥物的吸附。檢查方法：透析管內先盛入緩沖液（VI）管外加入已知藥物濃度為CA的緩沖液（V2）達到平衡時，測定管外藥物濃度CE，若符合CEvCAV2/（Vl+V2）則說明透析膜對藥物有明顯吸附，應進一步考察在不同濃度下藥物與半透膜的吸附程度，若吸附力與藥物濃度相關，則應當用相關曲線予以校正②donnan效應：如果藥物帶電荷，蛋白質也帶電荷，因電荷影響，可造成平衡時透析膜兩側游離藥物濃度不等。一般用高濃度緩沖液或中性鹽溶液作為透析液時可消除該反應。但當溶液pH值偏離蛋白質等電點太遠，且蛋白質濃度較高時，用高濃度緩沖液也不能消除時應考慮對該效應進行校正（二） 超濾法：用超濾膜將結合型藥物和游離藥物分離。超濾裝置：用超濾膜將超濾裝置分為上下兩部分，膜上為貯樣室，下為收集管。裝樣后離心強迫游離藥物隨血漿中水分以及其他小分子物質通過超濾膜影響因素及注意事項：超濾膜的選擇；超濾速度：3000-10000轉/分；超濾時間：5-15分；溫度：4/20/37C；超濾液體積：控制超濾后/超濾前體積比為0.3-0.6，因蛋白質濃度變化會引起藥物蛋白結合率變化（三） 凝膠過濾法：將血漿樣品溶液通過葡聚糖凝膠住，將游離型藥物與結合型藥物分離。只用于測定與蛋白結合率高的藥物。注意選擇凝膠類型，柱溫，洗脫液種類，洗脫流速等。凝膠柱：常用葡聚糖凝膠類型有G-25/G-50/G-125。柱溫：20-37C。洗脫液：一般為緩沖液，如pH值為7.5的磷酸鹽緩沖溶液，也有用5.5的緩沖液洗脫酸性藥物。洗脫流速：0.3-1mL/min（四） 超速離心法：將血漿或血清直接加入離心管，高速離心（150000-250000rpm）下離心分離，上清液含游離型藥物，沉淀含結合型藥物。注意分離過程中存在反擴散現(xiàn)象，溶液粘度影響分離效果，上清液中殘存蛋白的影響（五） 將白蛋白微球懸浮在緩沖溶液中，倒入底部具有孔板的注射器內，加入藥物混勻溫敷一定時間，推注注射器活塞，游離藥物隨緩沖液通過孔板滴入收集器。此法在一定程度上可反映藥物的血漿蛋白結合率（白蛋白約占血漿蛋白的60%）第二節(jié)腸內菌的生物轉化一、 水解反應：腸內進行的主要生物轉化反應，由腸內菌具有的B-葡萄糖苷酶、B-鼠李糖苷酶、B-葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶等催化完成。將苷在苷酶作用下轉化為苷元。二、 氧化反應：腸內菌對中藥成分的氧化生物轉化，最典型的例子是黃酮類化合物。不同類型黃酮類化合物由腸內菌氧化轉化引起的骨架開裂具有一定規(guī)律性。A.黃酮一C6-C3型酚酸；B.黃酮醇一C6-C2型酚酸；C.二氫黃酮一C6-C3型酚酸；D.異黃酮一乙基酚衍生物；E.黃烷醇一C6-C3型酚酸（經(jīng)過苯基-B-戊酸內酯中間體）；F.花色素一C6-C1型酚酸三、 還原反應：硝基還原酶和亞硝基還原酶，腸內菌含有豐富，而肝臟不含有。其他還原酶如3B-羥基甾體脫氫酶四、 異構化反應：光學活性和立體選擇性轉化五、 含氧化合物向含氮化合物的轉化：腸內菌可使某些含氧化合物轉化為含氮化合物，其中氮元素來源于腸內菌氮代謝產(chǎn)生的氨。環(huán)烯醚萜類化合物主要存在該轉化。六、 脫?；ソ猓┳饔茫耗c內菌中含有酯酶，可進行~七、 酯化作用：與酯解作用相反，某些腸內菌也能將自身胞壁組成成分脂肪酸與藥物結合產(chǎn)生新的酯，如烏頭堿的腸內菌轉化。八、 聚合作用：當某些中藥成分生物轉化中間體反應活性較高時，它們之間也能聚合形成穩(wěn)定的終產(chǎn)物，如紫草素的人腸內菌轉化第三節(jié)肝臟代謝和生物轉化親脂性化合物雖然易于透過細胞膜被消化道吸收，但不易從腎臟排出，堆積體內造成毒害作用，只有經(jīng)肝臟等器官的氧化還原水解結合等一系列代謝反應轉為極性大的化合物，使之易于排出體外。大部分藥物的肝臟代謝是滅活過程。個別藥物的肝臟代謝可增強活性，如嗎啡。一、 藥物代謝的氧化反應：最重要最普遍。某些氧化反應由線粒體和細胞之中的脫氫酶或氧化酶催化；大部分氧化反應由肝臟線粒體單加氧酶末端酶系細胞色素P450催化C-烷基的氧化:①被單加氧酶將末端甲基及其臨危亞甲基氧化，生成相應醇，多數(shù)情況下醇繼續(xù)被脫氫酶氧化，轉化為相應的羧酸或酮②若短鏈甲基和乙基烷烴直接結合到雙鍵和芳香環(huán)上，結合部位容易氧化③甲基、亞甲基和次甲基的氧化活性依次降低N-烷基的氧化：微粒體FAD-單加氧酶（胺氧化酶）催化許多化合物中的N氧化，催化仲胺的羥基化和叔胺、羥胺的氧化。伯胺：首先生成羥胺，再繼續(xù)氧化成亞硝基和硝基化合物。仲胺：氧化成羥胺再進一步生成不穩(wěn)定的氮羰化合物，后水解成醛和一元羥胺。叔胺：氧化生產(chǎn)N-氧化物。脂肪環(huán)的羥基化：脂肪環(huán)化合物由于具有亞甲基結構，同直鏈狀烷烴一樣抑郁氧化代謝。芳香環(huán)的氧化：芳香環(huán)上的氫被羥基取代是芳香環(huán)氧化的特征，又稱羥基化反應。電子密度高的部位優(yōu)先氧化雙鍵的氧化：雙鍵臨危的亞甲基易于被氧化代謝，但雙鍵本身也能夠被氧化代謝生成環(huán)氧化物。在生物體中形成的該類環(huán)氧化物可迅速被存在于肝微粒體或肝細胞可溶部分的環(huán)氧化物水解酶分解。環(huán)氧化物常與生物體內源性大分子蛋白質以及核酸等共價結合，導致組織壞死和癌變二、 藥物代謝的還原反應：能夠進行還原反應的官能團有硝基、偶氮基、羰基、烯基、N-氧化物、S-氧化物、環(huán)氧化物、過氧化物等。醛-酮還原酶：羰基化合物（醛、酮）羰基變?yōu)榱u基。硝基還原酶：芳香硝基化合物變?yōu)榉及?，偶氮化合物變?yōu)榘?。三?藥物代謝的水解反應（一） 環(huán)氧化物的水解。環(huán)氧化物的環(huán)氧三元環(huán)應力大，反應性強，可與多種生物體成分發(fā)生親電反應而使細胞壞死、突變、癌變。生物體防御這種有害反應發(fā)生的酶類有環(huán)氧化物水解酶，將環(huán)氧化物催化為反式鄰二醇。（二） 糖苷鍵的水解：糖苷鍵水解是糖和苷類化合物進入生物體后最普遍的反應?？诜o藥，水解反應主要發(fā)生在胃腸道內。靜脈給藥，主要發(fā)生在肝臟和腸肝循環(huán)。（三） 酯基的水解：能夠水解酯鍵的酶稱為酯酶。（四） 酰胺基的水解：能夠水解酰胺鍵的酶稱為酰胺酶。酰胺酶和酯酶沒太大區(qū)別，但酰胺酶水解慢。四、 藥物代謝的結合反應：藥物經(jīng)過第一相的氧化、還原水解等生物轉化，代謝物進入第二相與生物內源性分子如葡萄糖醛酸、硫酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸或其他氨基酸、硫氰酸鹽結合或乙?；⒓谆?，生成水溶性的無藥理作用（一般來說）的產(chǎn)物，從尿液或膽汁排出。使極性增加：葡萄糖醛酸、磷酸、氨基酸、谷胱甘肽結合反應；氨基酸結合反應：甘氨酸、谷氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸等與游離羧基結合。谷胱甘肽結合反應受谷胱甘肽轉移酶催化。五、 甲基化反應：有O-/N-/S-甲基化反應，分別由O-/N-/S-甲基轉移酶催化。六、 乙酰化反應：含氨基藥物，由乙?；D移酶催化完成。以氧化反應為主。屬底物非專一性反應，反應底物種類多。代謝產(chǎn)物極性、水溶性增大。代謝反應競爭性與序列性并存、相互交叉、代謝反應是多因素綜合作用的結果。第四節(jié)體內分析樣品制備三、生物樣品預處理目的：使待測成分處于綴合狀態(tài)；考慮因素：待測成分的酸堿性、極性、穩(wěn)定性、蛋白質結合度；濃度高低、分析方法；生物樣品性質四、蛋白質的去除A?沉淀法：a.有機溶劑沉淀法：①常用有機溶劑有乙腈、丙酮、乙醇、甲醇等，沉淀蛋白的效力遞減②用1-3倍體積的有機溶劑可使90%以上蛋白質沉淀。b.鹽析法：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉。c.酸性試劑沉淀法：常用酸性試劑：三氯醋酸（最常用，但常含雜質，只是有些方法的空白值偏高，其次是出去蛋白質后如采用乙醚為提取溶劑，三氯醋酸會融入乙醚干擾測定）、高氯酸、苦味酸等。d.加熱沉淀法：適用于樣品對熱穩(wěn)定者酶消化法：①在溫和的理化條件下，水解生物蛋白，將與蛋白結合的成分釋放，對蛋白結合率強的成分可顯著改善回收率②避免成分在強酸下水解和較高溫度時降解③采用HPLC檢測時，無須進行過多凈化操作④常用的蛋白水解酶有枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶⑤枯草菌溶液（細菌性堿性蛋白分解酶）最常用，pH7.0-11.0內使蛋白質降解，50-60°C活性最大⑥加入蛋白酶激活劑可減少酶用量和縮短活化時間，如咖啡因與胃蛋白酶合用氯化鈣與胰蛋白酶合用C?超濾法、透析法、微孔濾膜過濾法：①與蛋白結合的待測成分未能被解脫出來而不能檢出②用于測定血清或血漿中游離待測成分的濃度4?綴合物（結合物）水解A?酸水解：①通常用無機酸②酸濃度、水解時間、是否加熱等條件隨成分而異③簡便快速，但與酶水解相比專一性較差④注意成分在水解過程中是否發(fā)生分解B?酶水解：①常用水解酶有葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶，在世界應用中多用混合酶②水解方法：pH4.5-7條件下加入酶，37C厭氧條件下溫育16小時③尿液采用酶水解，需預先出去尿中能抑制酶活性的陽離子④優(yōu)點：專屬性強，條件溫和，不易引起待測成分降解⑤缺點：用時長，用量大，酶制劑可能引入粘液蛋白等雜質，使綴合物乳化造成層析柱阻塞C?溶劑解：某些成分的硫酸酯，可在萃取溶劑的作用下發(fā)生分解四、生物樣品提取凈化1.液相提?。ㄒ?液提?。┨崛÷剩ㄝ腿÷剩┰隗w內成分分析中，由于樣品量少且成分含量低，待分析樣品數(shù)量較多，通常不采用反復提取的方法，多進行一次提取，因此成分提取率不可能太高，就一般分析而言，提取率不低于50%影響提取率的因素：提取溶劑①理想的提取溶劑對待測成分應具有大的親和力；與水不互溶；不影響分析檢測；化學性質穩(wěn)定；沸點適宜，價廉無毒②為了減少容器對待測成分的吸附損失，提高提取率，可在非極性提取溶劑中加少量醇水相pH值①對于酸堿性成分的提取率影響很大②pH的選擇主要根據(jù)待測成分的pka決定。一般來說，堿性成分的最佳pH應高于pka2-3個單位；中形成反可在任一pH條件下被提取,但以在pH偏高的情況下進行提取最好③為保證提取率的重現(xiàn)性，多采用緩沖溶液，以保持在提取過程中溶液pH穩(wěn)定離子強度：①離子強度增加（鹽析）有利于提高提取率②采藥離子鹽析效率由大到?。篗gCaSrBaLiNaKRbCs陽離子；枸緣酸根、酒石酸根、硫酸根、AcCl硝酸根氯酸根ISCN陰離子提取技術：①通常不采用反復提取，多半進行至多兩次提取，在用酸堿回提時也只進行一次，一般不考慮提盡藥物②提取溶劑必須精確加入，提取液要定量分出，其他操作應與建立標準曲線時相同，并進行平行操作③多采用內標加入法，即在樣品提取前，在各樣品中加入等量內標物，以待測組分響應值與內標物響應值之比對濃度作標準曲線，進行定量④有機溶劑與水相的體積比一般為1:1或2:1⑤混合方式：密塞情況下振蕩器振蕩，渦動混合器旋搖或首尾顛倒混合⑥玻璃容器表面會對成分產(chǎn)生吸附，為減少吸附可在提取溶劑中加少量異戊醇、二乙胺等，或對玻璃儀器進行硅烷化處理離子對提取法的提取條件反離子①烷基或芳基磺酸鹽、無機酸根等；用于呈陽離子狀態(tài)的成分②4-12個碳原子的烷基胺類；用于呈陰離子狀態(tài)的成分或代謝物，如酸性成分萃取溶劑：常用氯仿、二氯甲烷水相pH值①對離子對萃取有很大影響②最適宜pH應使成分完全解離③為保證提取率的重現(xiàn)性，多采用緩沖溶液,以保持在提取過程中溶液pH穩(wěn)定離子對提取方法的應用①適用于高度店里的親水性強的極性化合物提取，如尿液中水溶性大的綴合物②用于生物樣品中痕量成分的提取有獨到之處2．固相提?。ㄒ?固提?。┕滔嘀H脂型：活性炭、氧化鋁、氧化鎂、硅膠、鍵合相硅膠（烷基鍵合相、苯基鍵合相、氰基鍵合相）大孔吸附樹脂親水型：纖維素、硅藻土、硅膠（原理：分配作用，用與水不相混溶的有機溶劑洗脫親脂性待測成分，親水性雜質被滯留在固定相支持物上）離子交換型①陰離子交換樹脂：在中性、堿性條件下用于弱酸性成分②陽離子交換樹脂：在中性、酸性條件下用于弱堿性成分填料：①形狀：子彈型、針筒型②規(guī)格：填料量0.05-10g不等；體積1-60ml不等根據(jù)樣品體積大小，被測成分的含量及理化性質選擇①一般樣品體積小于1ml選用1ml固相柱；1-250mlf3ml；快速萃取時，選用6ml固相柱②被萃取成分量一般不超過填料量的5%⑴反相柱：先用固定相6-10倍量體積的甲醇或乙腈沖洗，濕潤固相填料，使其溶劑化，然后用6-10倍量體積的水或緩沖液沖洗（此溶劑的極性、pH、離子強度應與樣品液相似）使其達到良好的分離狀態(tài)⑵正相柱：采用固定相6-10倍量體積的非極性溶劑沖洗（通常用樣品溶劑來處理）⑶離子交換固定相：一般用水或弱緩沖溶劑處理將樣品溶于弱溶劑（如緩沖溶劑）中，緩慢加到固相柱上用強度適當?shù)娜跞軇ㄈ绾倭考状嫉乃┫礈?，使待測組分保留著固相柱上，洗去雜質，然后通氮氣流干燥固相柱改變洗脫溶劑的極性或pH,使待測成分從固相柱上解吸附，隨洗脫液流出，收集洗脫液影響固相提取的因素①合適的洗滌劑和洗脫劑②流速：流速太快會使待測成分與吸附劑不能充分接觸,導致與雜質的分離度下降，樣品流失，回收率降低或不能重現(xiàn)③上樣量：超載易引起回收率差或不穩(wěn)定,判斷是否超載,可進行樣品突破性實驗。方法為：取已知濃度樣品液；小體積上柱，用合適的洗脫方式洗脫；測定百分回收率；增大樣品上樣體積，重復前面步驟。繪制回收率與樣品上樣體積曲線，當回收率下降時，表明樣品超載固相提取的優(yōu)點①無乳化現(xiàn)象，待測成分不易損失②溶劑用量少③萃取效能和回收率高④操作安全省時速度快，引入污染少⑤選擇合適的溶劑洗滌后，可再生重復使用固相提取的發(fā)展趨向：想著操作更簡便，易于自動化的方向發(fā)展；方法：將提取柱與HPLC/GC系統(tǒng)相連，采用柱切換技術，可以達到自動化的樣品處理。樣品自動處理系統(tǒng)中，填料多為C18（粒徑30-40》m）血清或血漿樣品可直接進樣，提取柱一般長度為2cm,對脂溶性很強的待測成分可采用更短的柱第五節(jié)體內分析方法建立評價一、 樣品測定：對照品、對照品加水、空白、空白加對照、樣品二、 藥物分析方法評價指標：準確度、精密度、檢測限和定量限、專屬性、藥物穩(wěn)定性、標準曲線、重復性、耐用性、樣品測定（QC樣品）1.準確度A.回收率⑴提?。ㄝ腿?絕對）回收率＞50%能穩(wěn)定與重現(xiàn):往空白生物基質或含藥物的真實樣品中加入的藥物標準品已知量A，實際上是準確加入已知濃度的藥品標準品溶液一'定體積，使兩種考核樣品內含總藥濃應包括高中低三種，其濃度分別接近公示樣品的最高藥濃Cmax（標準曲線的上限）、平均藥濃和最低藥濃Cmin（定量限）每個濃度應測定3-5次，并且測定值M的相對標準差符合以下精密度項下的要求，然后取均值M。內標法中，內標物提取回收率與待測物不相差10%萃取回收率測定方法①對比法：取甲（尖底）乙兩支試管，各精密加入等體積的藥物標準品溶液（一般為甲醇溶液）然后通空氣或氨氣揮干，甲作對照，乙中準確加入空白體液一①樣品：大黃素制劑②實驗動物：狗③給藥途徑：口服色譜條件的確定：采用HPLC法，確定流動相等成分，熒光法測定。柱溫：室溫。血漿樣品的制備：取得全血后加入抗凝劑后離心取得上清液即血漿，立即冷凍貯存?zhèn)溆?。含藥血漿測定。不同時間點對含藥血漿進行相關測定，繪制時效曲線。使用時采用液液萃取法預處理血漿并進行萃取回收率樣品藥物回收率的測定。標準曲線的制備：標準濃度應包括一定梯