第二章 核酸、染色體及基因

Chapter2核酸、染色體及基因Nucleicacid，ChromosomeandGene2.1核酸(NucleicAcids)DNA和RNA，是核苷酸的聚合體核苷酸由含氮堿基、五碳糖和磷酸組成堿基嘌呤（purine）：雙環(huán)結(jié)構(gòu)腺嘌呤（adenine）鳥嘌呤（guanine）嘧啶（pyrimidine）：?jiǎn)苇h(huán)結(jié)構(gòu)胞嘧啶（cytosine）尿嘧啶（uracil）RNA胸腺嘧啶（thymine）核苷及核苷酸堿基共價(jià)結(jié)合于戊糖的1’位構(gòu)成核苷，RNA中的戊糖為核糖，而DNA中為2’-脫氧核糖。核糖與堿基的結(jié)合位置嘧啶為1位，嘌呤為9位。核苷與一個(gè)或多個(gè)磷酸分子連接便成稱為核苷酸。堿基配對(duì)氫鍵鏈的延伸DNA單鏈的延伸5’端3’端DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)帶有負(fù)電的磷酸－戊糖骨架在分子外側(cè)堿基平面堆積于螺旋內(nèi)部由于骨架雙鏈在螺旋軸上的間距不相等，因而在分子表面形成寬窄不等的大溝和小溝雙鏈之間對(duì)應(yīng)的堿基以氫鍵作用形成堿基對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中每一匝螺旋含有約10個(gè)堿基對(duì)兩條鏈反向排列DNA的分子結(jié)構(gòu)（B-型）A型、B型及Z型螺旋生物體內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)是基本一致的，即所謂的B型螺旋（最穩(wěn)定）在低溫條件下，DNA分子可以變構(gòu)形成A型螺旋，結(jié)構(gòu)更加緊密、更寬，螺旋重復(fù)每匝為11個(gè)堿基對(duì)左旋DNA為Z型DNA，屬于異常螺旋形式，外觀呈Z字型，每匝12堿基對(duì)，不是體內(nèi)DNA的主要形式ABZABZZ-DNA的磷酸核糖骨架是扭曲的核酸的理化性質(zhì)酸效應(yīng)在強(qiáng)酸和高溫下,核酸可以完全水解為堿基、核糖（脫氧核糖）和磷酸DNA化學(xué)測(cè)序法就是以此為基礎(chǔ)的堿效應(yīng)直接影響堿基之間作用力，導(dǎo)致DNA雙鏈的解離變性O(shè)H5’-OH

強(qiáng)堿2,3環(huán)磷酸二脂

RNA在強(qiáng)堿條件下會(huì)水解成2,3環(huán)磷酸二脂等化學(xué)變性一些化學(xué)物質(zhì)，比如尿素（Urea）、甲酰胺（Formamide）能破壞堿基堆積力，從而使DNA變性。這些化學(xué)變性劑廣泛地使用在變性、Soutern-blot、Northern-bolt上。黏性DNA分子具有高軸比（axialratio）寬2nm,長(zhǎng)達(dá)μm、mm級(jí)，甚至某些真核長(zhǎng)達(dá)幾cmDNA是比較剛性（relativelystiff）的分子核酸的光譜學(xué)DNA與RNA的最大吸收波長(zhǎng)為260nm；紫外線的吸收能力：ssRNA>ssDNA>dsDNA；這種雙鏈ＤＮＡ的吸收值減少的現(xiàn)象稱為“減色效應(yīng)”。核酸定量吸光值（Extinctioncoefficient）1mg/mldsDNA:A260

=201mg/mlssDNA&RNA:A260

=25ＤＮＡ純度常用260nm與280nm處的吸光值來(lái)確定：純的dsDNA的A260／A280為1.8純RNA的A260／A280為2.0若樣品的A260／A280>1.8,則表明有RNA污染若樣品的A260／A280<1.8,則表明有蛋白質(zhì)污染ＤＮＡ超螺旋所有天然的ＤＮＡ分子整體都呈負(fù)超螺旋（negativelysupercoiling）超螺旋ＤＮＡ分子一般比松弛的ＤＮＡ分子具有更高的能量，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，便于控制復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的起始細(xì)胞中存在拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerases）控制ＤＮＡ分子的超螺旋狀態(tài)環(huán)狀線性正超螺旋：DNA扭曲方向與雙螺旋方向相同；負(fù)超螺旋：DNA扭曲方向與雙螺旋方向相反I-型拓?fù)洚悩?gòu)酶纏繞數(shù)以±1變化II-型拓?fù)洚悩?gòu)酶纏繞數(shù)以±２變化負(fù)超螺旋電鏡圖2.2原核生物的染色體結(jié)構(gòu)大腸桿菌的染色體閉環(huán)DNA，長(zhǎng)度約4.6Mb，集中分布在成為“擬核”（nucleoid）的區(qū)域內(nèi)，在正常生長(zhǎng)情況下DNA保持連續(xù)復(fù)制。BacterialDNAiscompactedinastructurecalledthenucleoid,whichoccupiesalargefractionofthebacterialcell‘svolume.2.2.1DNA結(jié)構(gòu)域?qū)⒋竽c桿菌DNA與大多數(shù)結(jié)合蛋白分離開來(lái)，在電子顯微鏡下可觀察到由50－100個(gè)環(huán)或結(jié)構(gòu)域組成，這些環(huán)或結(jié)構(gòu)域的末端與細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)連接而固定。大腸桿菌DNA結(jié)構(gòu)域電鏡圖2.2.2基因組超螺旋電鏡結(jié)構(gòu)顯示，就整體而言，大腸桿菌的基因組是由大量超螺旋的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的。2.2.3DNA結(jié)合蛋白原核生物的染色體中環(huán)型的DNA由于大量的DNA結(jié)合蛋白相互作用而進(jìn)一步受到束縛，進(jìn)而包裝形成類核。DNA-結(jié)合蛋白:HU蛋白：小的二聚體非特異結(jié)合蛋白H-NS蛋白：?jiǎn)误w中性蛋白

特異的DNA結(jié)合蛋白(polymerases，etc.）2.3染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（ChromatinStructure）真核生物的基因組比原核生物大數(shù)千倍由一定數(shù)目的染色體組成每條染色體中的DNA分子為單一線性分子所有DNA分子必須包裝在細(xì)胞核內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的DNA濃度極高

高度有序的DNA－蛋白質(zhì)復(fù)合體——染色質(zhì)蛋白質(zhì)組分占染色質(zhì)質(zhì)量的50％以上在細(xì)胞周期的不同時(shí)段中，染色質(zhì)具有不同的結(jié)構(gòu)2.3.1組蛋白分類核心組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）H1：分子量較大，含量?jī)H為其他組蛋白的一半組成帶有大量的正電荷—可與帶負(fù)電的DNA緊密結(jié)合20％－30％由賴氨酸和精氨酸（堿性氨基酸）組成Corehistones(H2A,H2B,H3andH4):10-20kDa定位在核小體中央：(H2A)2(H2B)2(H3)2(H4)2

序列高度保守H1histone:23kDa定位在核小體外圍,與DNA的結(jié)合松散序列不保守、易變異2.3.2核小體（nucleosome）核小體包含于染色質(zhì)中約200bp左右的DNA片段與4種組蛋白中的各2個(gè)分子構(gòu)成的八聚體（核心組蛋白）緊密結(jié)合，并與H1松散結(jié)合；這些組蛋白保護(hù)DNA免受核酸酶的作用；組蛋白的另一個(gè)作用是約束DNA的負(fù)超螺旋；如果丟失H1，核小體將變?yōu)榕c組蛋白八聚體結(jié)合的146bp片段。TopviewSideview2.3.3連接DNA（LinkerDNA）thelinkerDNAbetweenthenucleosomecoresvariesbetweenlessthan10andmorethan100bp,butisnormallyaround55bp.Thenucleosomalrepeatunitishencearound200bp.2.3.430nm纖絲核小體將進(jìn)一步組裝成更高級(jí)別的空間結(jié)構(gòu),稱為30nmfiber或螺線管；左手螺旋六個(gè)核小體每圈2.3.5高級(jí)結(jié)構(gòu)Onthelargestscale,chromosomalDNAisorganizedintoloopsofupto100kbintheformofthe30nmfiber,constrainedbyaproteinscaffold,thenuclearmatrix.TheoverallstructuresomewhatresemblesthatoftheorganizationaldomainsofprokaryoticDNA.2.4真核生物染色體的結(jié)構(gòu)特征有絲分裂染色體著絲粒端粒異染色質(zhì)常染色質(zhì)CpG甲基化特殊的染色體2.4.1有絲分裂染色體ReplicationoccursduringSphaseG1andG2areintervalstoprovideadditionaltimeforcellgrowth.Celldivision.AparentalcellinG1hastwocopiesofeachchromosome(2n),onematernal(red)andonepaternal(blue).ChromosomesarereplicatedduringtheSphase,givinga4nchromosomalcomplement.Atthemidpointofmitosis(metaphase),thereplicatedchromosomesarealignedandheldinpositionbythemitoticapparatus.Thetwoidenticalchromatidscomposingeachreplicatedchromosomethenmovetooppositeendsofthecell,thenuclearmembranere-formsaroundeachsetofchromosomes,andfinallycytokinesissplitsthecellintotwogeneticallyidenticaldaughtercells.

2.4.2著絲粒、端粒著絲粒（Centromeres）著絲粒是分裂中期兩條姊妹染色單體相連的緊縮區(qū)域，是一種與紡錘體相連的部位。端粒（Telomere）端粒是形成真核生物染色體的線型DNA分子末端的特化了的序列，由許多短重復(fù)序列構(gòu)成（人類是5’－TTAGGG－3’）；這些序列是由端粒酶以獨(dú)立于正常DNA復(fù)制的機(jī)制合成的，其功能是保護(hù)染色體末端免受降解。端粒的結(jié)構(gòu)端粒起到細(xì)胞分裂計(jì)時(shí)器的作用，端粒的核苷酸每復(fù)制一次減少50-100bp，其復(fù)制要靠具有反轉(zhuǎn)錄酶性質(zhì)的端粒酶（telomerase）來(lái)完成，正常體細(xì)胞缺乏此酶，故隨細(xì)胞分裂而變短，細(xì)胞隨之衰老。

熒光原位雜交顯示的端粒

端?？赡芟拗屏巳祟悏勖?鹽湖城猶他大學(xué)的遺傳學(xué)家Ｒｉｃｈａｒｄ

Ｃａｗｔｈｏｎ及其同事檢查了１４３名老年男女的端粒長(zhǎng)度--這些人曾經(jīng)在至少１５年前提供過血樣。研究小組在《柳葉刀》雜志上報(bào)告說(shuō)，那些端粒短于平均長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)參與者比那些端粒較長(zhǎng)的參與者早死４到５年，而且死于心臟病的幾率比后者高３倍多。端粒最短的參與者（即最短的那２５％）死于傳染病的幾率比那些端粒較長(zhǎng)的人高８倍多。

四膜蟲的端粒復(fù)制機(jī)制2.4.3異染色質(zhì)(heterochromatin)異染色質(zhì)是細(xì)胞間期及早前期時(shí)仍處于凝集狀態(tài)的染色質(zhì)。具有強(qiáng)嗜堿性，染色深，染色質(zhì)絲包裝折疊緊密，與常染色質(zhì)相比，異染色質(zhì)是轉(zhuǎn)錄不活躍部分，多在晚S期復(fù)制。異染色質(zhì)分為結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)和兼性異染色質(zhì)兩種類型。結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是指各類細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)處于凝集狀態(tài)的染色質(zhì)，多定位于著絲粒區(qū)、端粒區(qū)，含有大量高度重復(fù)順序的脫氧核糖核酸（DNA），稱為衛(wèi)星DNA（satel-liteDNA）。兼性異染色質(zhì)只在一定細(xì)胞類型或在生物一定發(fā)育階段凝集，如雌性哺乳動(dòng)物含一對(duì)X染色體，其中一條始終是常染色質(zhì)，但另一條在胚胎發(fā)育的第16～18天變?yōu)槟癄顟B(tài)的異染色質(zhì)，該條凝集的X染色體在間期形成染色深的顆粒，稱為巴氏小體（Barrbody）。

堿性染料對(duì)分裂間期細(xì)胞的染色染色體＝常染色質(zhì)＋異染色質(zhì)性別鑒定

女性有兩條X染色體，通常只有一個(gè)發(fā)揮作用，另一個(gè)即使在分裂間期也常呈凝聚狀態(tài)（異染色體），染色后可在光學(xué)顯微鏡下看見一個(gè)斑點(diǎn)（巴氏小體)。男性只有一條X染色體，分裂間期不凝聚，無(wú)斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)。2.4.4常染色質(zhì)

(Euchromatin)異染色質(zhì)的對(duì)應(yīng)詞。指在間期（interphase）或核分裂前期和末期時(shí)不能被濃染的染色體的主體部分。在間期核中遺傳信息的表達(dá)主要在這部分進(jìn)行。常染色質(zhì)中的與DNA結(jié)合的組蛋白在質(zhì)上和量上都與異染色質(zhì)中的不同。2.4.5CpG甲基化DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動(dòng)物中mC約占C總量的2－7％。CH3CH3C5m-CT:::GGACpG甲基化引起的突變CpG的甲基化主要出現(xiàn)在染色質(zhì)中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)；CpG的非甲基化形式（CpG島）出現(xiàn)在持家基因區(qū)域，尤其是啟動(dòng)子區(qū)域。這些CpG島通常的長(zhǎng)度約為2000bp。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明，人類基因組CpG島約為28890個(gè)，大部分染色體每1Mb就有5—15個(gè)CpG島。2.4.6特殊的染色體1881年意大利的Balbiani發(fā)現(xiàn)于雙翅目搖蚊幼蟲的唾腺細(xì)胞。其特點(diǎn)是體積巨大，比其它體細(xì)胞染色體長(zhǎng)100-200倍，體積大1000-2000倍，這是由于核內(nèi)有絲分裂的結(jié)果，即染色體多次復(fù)制而不分離。多線染色體

2.5基因組的復(fù)雜度非編碼DNA單一序列DNA串聯(lián)基因簇分散重復(fù)DNA衛(wèi)星DNA2.5.1非編碼DNA人類基因組的眾多基因中，人們發(fā)現(xiàn)只有不到10％的DNA序列參與了編碼蛋白質(zhì)或者酶，而剩下90％沒有顯示出那些功能，而植物中編碼基因僅占不到3%。于是就有人認(rèn)為它們是沒有用的“垃圾DNA”,垃圾DNA真的是垃圾嗎?基因內(nèi)：內(nèi)含子基因間：一些串聯(lián)重復(fù)DNA，如微衛(wèi)星DNA；多拷貝的分散的片段，如Alu元件。卵清蛋白球蛋白胰島素2.5.2單一序列DNA對(duì)于原核生物而言，大多數(shù)的ＤＮＡ片段都是單一序列；真核生物單一序列DNA占60~65%，為單拷貝/單一序列，在基因組中只出現(xiàn)一次或很少幾次，一般由800~1000bp組成，構(gòu)成編碼蛋白和酶的基因。2.5.3串聯(lián)基因簇這種多重復(fù)序列組成的基因簇，通常是其產(chǎn)物需求量很高的基因。編碼核糖體的基因是最有代表性的串聯(lián)基因簇。rRNA

18S-5.8S-28SrRNA的編碼基因45SrDNA有10-10000個(gè)拷貝，因物種而異。人類有２００個(gè)拷貝，分布在５條染色體上。組蛋白的編碼基因

５個(gè)組蛋白編碼基因（H2A,H2B,H3,

H4,H1）重復(fù)可達(dá)數(shù)百次。2.5.4分散重復(fù)DNA長(zhǎng)散布元件(Longinterspersingelement,LINE)1000-5000個(gè)堿基對(duì)，重復(fù)102～104次。短散布元件(shortinterspersingelement,SINE)數(shù)百個(gè)堿基對(duì)，重復(fù)次數(shù)可達(dá)10萬(wàn)次以上，例如Alu元件。Alu序列:300bp，序列中含有一個(gè)Alu酶切位點(diǎn)，能將其切為兩個(gè)片段，故稱Alu序列。是人類基因組特有的含量豐富的中度重復(fù)序列，30~50萬(wàn)拷貝。Alu序列與L1元件占到人類基因組的１０％。2.5.5衛(wèi)星ＤＮＡ衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)是一類高度重復(fù)序列

DNA在介質(zhì)氯化銫中作密度梯度離心，離心速度可以高達(dá)每分鐘幾萬(wàn)轉(zhuǎn)；此時(shí)DNA分子將按其大小分布在離心管內(nèi)不同密度的氯化銫介質(zhì)中，小的分子處于上層，大的分子處于下層；從離心管外看，不同層面的DNA形成了不同的條帶。根據(jù)熒光強(qiáng)度的分析，可以看到在一條主帶以外還有一個(gè)或多個(gè)小的衛(wèi)星帶。這些在衛(wèi)星帶中的DNA即被稱為衛(wèi)星DNA，這種DNA的GC含量一般少于主帶中的DNA，浮力密度也低。

小衛(wèi)星(minisatelliteDNA)又稱可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)(Variablenumbertamdemrepeat，VNTR)

由短重復(fù)單位(6-40bp)串聯(lián)重復(fù)(6-100次以上)而成，多位于基因的非編碼區(qū)，廣泛分布。VNTR多態(tài)性—分子標(biāo)記—DNA指紋圖（fingerprint）.

微衛(wèi)星（microstalliteDNA）又稱短串聯(lián)重復(fù)

（shorttandemrepeat,STR）1-10個(gè)核苷酸組成的重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)(10-60次),兩側(cè)為特異的單拷貝序列，人基因組中每l0kbDNA序列至少一個(gè)STR序列。兩側(cè)為特異的單拷貝序列。2.6基因的結(jié)構(gòu)2.6.1重疊基因

F.Sanger1977ΦX174dntsequencingC=5387bpc=11×2000bpOverlappinggenes!基因重疊方式Mis-readingforstopcodon

400Nt800NtAUGUGAUAA

14KdCp97%38KdIp3%

UGA,UAG易被漏讀，錯(cuò)讀

UAA能嚴(yán)格終止

AlternatedifferentreadingframeATG//AATGCC//ATAACG//--TAAAgeneBgeneATGCCNNNATAAStartStopstopstartTCAUGCCCAAACUAGGC最為常見AUGTCAUGCCCAAAUGAGGCVp2Start

Selectiondifferentstartcod