灰色鏈霉菌產(chǎn)鏈霉素匯報(bào)

灰色鏈霉菌產(chǎn)鏈霉素2023/2/51實(shí)驗(yàn)背景實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)論討論ABCDEContents目錄2023/2/52一、實(shí)驗(yàn)背景

灰色鏈霉菌是一種放線菌，而高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基是一種合成培養(yǎng)基，可用于培養(yǎng)放線菌。種子擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵工程的一個(gè)組成部分，指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。

種子擴(kuò)培的一般過(guò)程是：斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）→二級(jí)種子培養(yǎng)(種子罐)→發(fā)酵。根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和檢品兩者對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌圈大小來(lái)測(cè)定供試品的效價(jià)。2023/2/53二、實(shí)驗(yàn)方法1、灰色鏈霉菌的活化1.1培養(yǎng)基的制備本實(shí)驗(yàn)原計(jì)劃采用高氏培養(yǎng)基活化菌種，后因效果不佳，改用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。因此制備PDA培養(yǎng)基。1.2斜面接種1)左手拿試管菌種，右手拿接種環(huán)，先將金屬環(huán)燒灼滅菌，再將接種環(huán)在空白培養(yǎng)基處冷卻，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻2023/2/542)左手將試管菌種放下，拿起斜面培養(yǎng)基。在火焰旁用右手小指和手掌邊緣拔下棉塞并夾緊，迅速將接種環(huán)伸入空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時(shí)由底部向上劃一直線，一直劃到斜面的頂部。注意勿將培養(yǎng)基劃破，不要使菌體沾污管壁。3）灼燒試管口，在火焰旁將棉塞塞上。接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須灼燒滅菌后才能放下。4）斜面置于28℃恒溫箱中，培養(yǎng)2~3d觀察結(jié)果。2023/2/552、種子液的制備將活化的菌種斜面，在無(wú)菌的條件下，注入10mL無(wú)菌水，震蕩成孢子懸浮液（孢子濃度約為8×104個(gè)/mL）。待發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后冷卻到28℃時(shí)，分別將孢子懸浮液接入三角瓶中，接種量為2mL，標(biāo)記。28℃、200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24h，觀察菌絲體形態(tài)及濃度。3、搖瓶大量發(fā)酵待發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml）滅菌后冷卻到30℃時(shí)，按接種量8%-10%進(jìn)行接種，即每個(gè)發(fā)酵瓶加入5ml種子液。32℃、100r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24h，發(fā)酵過(guò)程中，補(bǔ)加滅菌尿素以增加氮源，維持pH值。2023/2/564、枯草芽孢桿菌的活化將配制好的蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基斜面接種枯草芽孢桿菌，方法同灰色鏈霉菌活化方法相同。28℃培養(yǎng)24h。5、鏈霉素活性的鑒定5.1枯草芽孢桿菌懸液制備加入1ml生理鹽水于枯草芽孢桿菌斜面中，輕輕沖下菌落，取至新的滅菌的1.5mlEP管內(nèi)，備用。5.2枯草芽孢桿菌懸液的稀釋用生理鹽水將懸液分別稀釋5倍和10倍，備用。2023/2/575.3涂平板將制備好的不同濃度的枯草芽孢桿菌懸液涂布于4個(gè)制備好的LB平板，濃度分別為原液、5倍、10倍，第4個(gè)平板作為陽(yáng)性對(duì)照，懸液濃度為原液。5.4打孔將涂布好的平板用1ml槍頭打3個(gè)孔，孔徑光滑均一。5.5加樣將發(fā)酵液取10ml于10mlEP管內(nèi)，2000r/mim離心5min，取上清加于每個(gè)孔內(nèi)，加滿為止，但不能溢出。陽(yáng)性對(duì)照的孔內(nèi)加入一定濃度的鏈霉素液。37℃培養(yǎng)12h，觀察抑菌效果。2023/2/58實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備1、實(shí)驗(yàn)器材天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、紗布、18mL×180mL試管、棉花、電爐、燒杯、報(bào)紙、記號(hào)筆、酒精燈、接種環(huán)、250/500ml三角瓶、棉花、電爐、燒杯、記號(hào)筆、酒精燈、接種環(huán)、涂布棒、旋轉(zhuǎn)式搖床、4℃冰箱、37℃孵箱、各型號(hào)移液槍及槍頭、超凈工作臺(tái)等。2023/2/592、斜面培養(yǎng)基的制備2.1高氏培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g，氯化鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，瓊脂20g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制時(shí)注意，可溶性淀粉要先用冷水調(diào)勻后再加入到以上培養(yǎng)基中）。2.2PDA培養(yǎng)基：淀粉含量高的土豆、葡萄糖、瓊脂。將土豆切成小塊，煮爛用紗布濾出土豆汁。將1000ml的土豆汁中加入葡萄糖20g，瓊脂15-20g。2023/2/5102.3種子液的制備豆餅粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸銨3g，硫酸鎂0.25g，磷酸二氫鉀0.2g，碳酸鈣4g，自來(lái)水1000mL、pH7.2-7.4。2.4發(fā)酵液的制備水解糖160g、尿素5g（單獨(dú)滅菌）、MgSO40.5g、Na2HPO41.6g、玉米漿25~35g、FeSO4和MnSO4各20mg/L，消泡劑0.3g，，水1000mL，pH7.2。2023/2/511三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、灰色鏈霉菌的活化管中可見(jiàn)成片白色菌落，并且管底含有水。2023/2/5122、種子液的制備2023/2/5133、鏈霉菌的發(fā)酵2023/2/5144、枯草芽孢桿菌活化由于斜面培養(yǎng)基太軟，劃線的時(shí)候破壞了培養(yǎng)基，菌落也成片。2023/2/5155、鏈霉素的活性鑒定測(cè)得抑菌圈直徑為1.2cm1.2cm,1.4cm平均值為1.27cm枯草芽孢桿菌原液涂板所得抑菌圈圖片2023/2/516枯草芽孢桿菌稀釋五倍涂板所得抑菌圈圖片測(cè)得抑菌圈直徑為1.7cm，1.4cm,1.5cm平均值為1.53cm5、鏈霉素的活性鑒定2023/2/517測(cè)得抑菌圈直徑為1.8cm，1.4cm,1.5cm平均值為1.57cm枯草芽孢桿菌稀釋十倍涂板所得抑菌圈圖片5、鏈霉素的活性鑒定2023/2/518陽(yáng)性對(duì)照，枯草芽孢桿菌原液涂板所得圖片平板上未見(jiàn)預(yù)期結(jié)果，即透明的抑菌圈，培養(yǎng)基上也未長(zhǎng)菌。5、鏈霉素的活性鑒定2023/2/519四、結(jié)論通過(guò)活化灰色鏈霉菌并將其大量發(fā)酵，離心獲取產(chǎn)物即鏈霉素；通過(guò)打孔加入鏈霉素，觀察其抑菌圈大小判斷鏈霉素的效價(jià)，可評(píng)價(jià)制得鏈霉素的活性。2023/2/520五、討論1、由于考慮到鏈霉素的抑菌效果，我組采用不同倍數(shù)稀釋的枯草芽孢桿菌懸液。2、此次實(shí)驗(yàn)未取得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可能原因如下：