疾病診斷新方法-

疾病診斷新方法中國(guó)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室金春蓮DNA為基礎(chǔ)的疾病診斷新方法

飛速進(jìn)展的原因分子生物學(xué)新成就1.人類基因組計(jì)劃完成.2.很多疾病基因的定位,克隆,鑒定.3.功能基因組學(xué)研究的深入分子病因搞清楚----動(dòng)態(tài)突變、早現(xiàn)遺傳、非孟德爾遺傳現(xiàn)象等.分子生物學(xué)新技術(shù)

DNA、RNA、蛋白檢測(cè)新技術(shù)1.DNA重組技術(shù),分子雜交技術(shù).2.PCR技術(shù)----PCR-RFLP,PCR-SSCP,PCR-DGGE.3.DNA自動(dòng)測(cè)序.4.DNA芯片技術(shù).電子計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用

DNA為基礎(chǔ)的診斷領(lǐng)域檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)（DNA），基因功能表達(dá)（RNA、蛋白質(zhì)）判斷是否存在基因缺陷，是分子水平的病因診斷?；颊逥NA診斷性檢測(cè)a、不受被檢材料來(lái)源的影響b、晚發(fā)性遺傳病的癥狀前診斷成為可能c、分子水平闡明遺傳異質(zhì)性（基因座異質(zhì)性、等位基因異質(zhì)性）應(yīng)用這些特征可進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷一、概述(1)基因檢測(cè)必須要有針對(duì)目標(biāo)----特定基因(2)直接檢測(cè)特定基因的突變----位點(diǎn)、性質(zhì)(3)基因示蹤----連鎖分析受檢材料的選擇：DNA，RNA或蛋白質(zhì)DNA檢測(cè)樣品：

血液---最廣泛采用的成人DNA來(lái)源漱口液或頰膜刮片---群體篩查

絨毛膜絨毛活組織---產(chǎn)前診斷羊膜腔穿刺取羊水---產(chǎn)前診斷毛發(fā)，精液---法醫(yī)歸檔的病理學(xué)標(biāo)本---腫瘤研究Guthrie卡片---新生兒篩查及樣品保存取自8個(gè)細(xì)胞期胚胎的1--2個(gè)細(xì)胞---植入前診斷RNA優(yōu)于DNA，但更難于獲得與操作

1、目的基因易于獲得組織中表達(dá)

2、較大基因未知突變篩查

3、RT-PCR和DNA測(cè)序相結(jié)合可檢出DNA水平的突變，而且能可靠地檢測(cè)出hn-RNA加工過(guò)程的異常剪接。RNA檢測(cè)時(shí)要注意的一些問(wèn)題：①避免mRNA的降解②目的基因的表達(dá)組織③許多突變導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定，因此雜和個(gè)體的RT-PCR產(chǎn)物可能只顯示正常等位基因。

蛋白質(zhì)表達(dá)分析---檢測(cè)特異蛋白質(zhì)

免疫印跡（Westernblot）

免疫組織化學(xué)

免疫熒光技術(shù)蛋白質(zhì)截?cái)嘣囼?yàn)（proteintruncationtest,PTT）一種特異性的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)移碼突變、剪接位點(diǎn)突變或產(chǎn)生提前終止密碼子的無(wú)義突變。蛋白質(zhì)功能測(cè)定在遺傳檢測(cè)中發(fā)揮作用

免疫熒光技術(shù)

利用某些熒光素，如FITC、R-PE等通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測(cè)抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)未知抗原或相應(yīng)配體。二、基因檢測(cè)基本原理及常用技術(shù)1.核酸分子雜交雙鏈DNA變性

單鏈復(fù)性雜種DNA

加熱,強(qiáng)酸,探針

強(qiáng)堿,變性劑探針----一段與待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)的核苷酸序列,作為工作狀態(tài)的探針必須是單鏈.常用探針?lè)N類----基因組DNA,cDNA,人工合成的寡核苷酸.探針標(biāo)記放射性同位素標(biāo)記法-----缺口平移法,末端標(biāo)記法,隨機(jī)引物標(biāo)記法.非放射性標(biāo)記法-----地高辛標(biāo)記,生物素標(biāo)記,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記等.(1)斑點(diǎn)雜交(Dotblottinghybridization)

主要應(yīng)用于基因缺失,和拷貝數(shù)改變

ASO探針----檢測(cè)已知點(diǎn)突變.(2)Southern印跡雜交1975年EdwardSouthern建立的檢測(cè)DNA技術(shù).基因組DNA限制酶消化凝膠電泳分離變性轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(尼龍膜)固定預(yù)雜交探針

雜交洗膜放射自顯影分析雜交片段的大小及密度.能推測(cè):1.DNA片段的缺失,插入,重排等.2.改變限制酶酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變.3.DNA擴(kuò)增等拷貝數(shù)改變.4.RFLP等多態(tài)性.NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP

，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP隨機(jī)引物標(biāo)記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復(fù)姓SouthernBlotDNA

樣品

應(yīng)用：1）混合樣品DNA鑒定2）基因缺失檢測(cè)3）基因表達(dá)分析

點(diǎn)樣Probe-32P檢測(cè)AB1234(3)Northern印跡雜交

檢測(cè)RNA的分子雜交技術(shù)提取組織總RNAoligodT

mRNA含甲醛

的瓊脂糖凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移預(yù)雜交探針雜交洗膜放射自顯影

檢測(cè)特異mRNA大小和表達(dá)量.(4)原位雜交及熒光原位雜交(Flurescenceinsituhybridization,FISH)

染色體標(biāo)本上,組織切片上分子雜交NortherBlot原位雜交----3H標(biāo)記探針FISH-----熒光素或生物素標(biāo)記應(yīng)用于基因定位，染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常診斷。組織切片上的FISH----mRNA水平表達(dá)及一些病原體感染診斷。2.PCR技術(shù)（Polymerasechainreaction)1985年美國(guó)cetus公司的KaryMullis創(chuàng)建，80年代一向革命性技術(shù)，1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。模擬生物體內(nèi)的DNA復(fù)制，在體外DNA聚合酶酶促合成某一特異DNA片斷的技術(shù)。步驟：

變性

20----30周期復(fù)性延伸引物的核苷酸順序?qū)Q定擴(kuò)增片斷特異性及其長(zhǎng)度，該技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，快捷，目前自動(dòng)化操作。（1）PCR----RFLP（2）PCR----SSCP(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)

(3)PCR----DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis）（4）PCR---DHPLC

PCRPCR擴(kuò)增三、篩查致病基因突變篩查致病基因的缺陷----點(diǎn)突變、缺失、重復(fù)、重排及動(dòng)態(tài)突變等。受諸多因素的限制，僅限于

遺傳方式已知，

致病基因或cDNA已被克隆分離，致病基因的突變性質(zhì)與疾病關(guān)系已被闡明等前提下。未知點(diǎn)突變檢測(cè)缺失（重復(fù)）檢測(cè)PCR----SSCP

1、多重PCRPCR----DGGE2、MAPHPCR----DHPLC3、MLPA4.Sequencing5.DNA芯片技術(shù)

（1）PCR-SSCP原理：PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率。相同長(zhǎng)度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別，可產(chǎn)生不同的構(gòu)象，造成泳動(dòng)變位。能檢測(cè)已知和未知的堿基置換。長(zhǎng)度相同，但只要一個(gè)堿基的差別→形成不同構(gòu)象→泳動(dòng)速率不同→形成不同泳動(dòng)帶PCR-SSCP過(guò)程：

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

↓

變性

↓

單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影

↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

.

PCR-SSCP過(guò)程

關(guān)鍵是電泳條件----凝膠的溫度,離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等相關(guān).該方法靈敏度高,但存在假陰性,檢出率約有80%.（3）PCR-DGGE原理：利用DNA片段的溶解性質(zhì)，使同源和異源雙鏈分離的電泳系統(tǒng)。PCR擴(kuò)增后的DNA片段在變性梯度由低到高的聚丙烯酰胺凝膠電泳過(guò)程中，使正常和突變的同源和異源雙鏈DNA產(chǎn)生泳動(dòng)變位，使其分離。能檢測(cè)未知的堿基置換。垂直DGGE結(jié)果

圖3確定變性劑濃度范圍20%-80%6%DGGE檢測(cè)家系成員PAH基因外顯子6的電泳圖：Ⅱ1Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ2

ⅠⅡ121N？(3)PCR-DHPLC也稱WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)。原理：利用高效液相色譜原理，通過(guò)一個(gè)DNA分離柱----DNASep柱進(jìn)行核苷酸片段的分離和分析。DNASep柱分離：

①在非變性條件下（50oC）DNA雙鏈按長(zhǎng)度分離。

②部分變性條件下（95oC變性后逐漸冷卻到一定溫度）雜合雙鏈和純合雙鏈（有突變時(shí)）能分離。③完全變性條件下，DNA雙鏈解開，二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，DNA或RNA單鏈按堿基順序分離。DNA部分變性條件下檢測(cè)DNA變異的原理：

變異型和野生型DNA可形成同源和異源雙鏈．其在色譜柱上保留時(shí)間存在差異，異源雙鏈因存在錯(cuò)配區(qū)而更易變性，在色譜柱保留時(shí)間短于同源雙鏈而先被洗脫下來(lái)，從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線，據(jù)此可以分辨出變異型DNA.在經(jīng)歷95℃變性再緩慢復(fù)性后,存在多態(tài)或突變位點(diǎn)的靶序列PCR產(chǎn)物會(huì)雜交形成雜合雙鏈(heteroduplex)和純合雙鏈(homoduplex)混合物

DHPLC的特點(diǎn)：靈敏，準(zhǔn)確；分析速度快，單個(gè)樣本的分析時(shí)間僅需幾分鐘；容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作；適用于較大樣本中基因突變的篩查檢測(cè)變異的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍最好在200～500bpDHPLC可應(yīng)用于：①DNA片段已知和未知點(diǎn)突變的檢測(cè)及突變篩查。②RFLP，STRs，SNP等多態(tài)的研究及基因型分析。③甲基化分析。④基因表達(dá)的定量及基因表達(dá)差異分析。⑤寡核苷酸的分析及純化。（4）DNA測(cè)序Sanger法-----雙脫氧核苷酸末端終止法。P-OH2C不能形成5’磷酸和

5’堿基3’OH之間的磷酸

4’1’二脂鍵（因3’也脫

3’2’氧）而終止反應(yīng)。

HH4個(gè)反應(yīng)體系分別加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，將產(chǎn)生不同長(zhǎng)度（在A，G，C，T處隨機(jī)終止）的DNA片段，分別在變性凝膠電泳分離呈梯狀帶型，自下而上是5’3’被合成的DNA鏈順序。DNA自動(dòng)測(cè)序應(yīng)用如上原理，不同的是①4種不同熒光染料標(biāo)記的dNTP摻入酶促反應(yīng)(不用分4個(gè)反應(yīng)體系).②經(jīng)過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳分離(不用分4個(gè)泳道).③激光分析和計(jì)算機(jī)處理,直接標(biāo)出堿基序列.（5）DNA芯片技術(shù)在雜交和測(cè)序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的.①.大規(guī)模集成電路手段把成千上萬(wàn)個(gè)寡核苷酸探針有規(guī)律地排列在指甲大小的芯片上----制作寡核苷酸陣列.②.將待測(cè)的DNA,RNA或cDNA用熒光標(biāo)記后在DNA芯片上與探針雜交.③.用激光共聚焦顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行掃描,配合計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào),得出所需信息.

基因芯片如：

靶基因

基因組

特異性片段探

針

----AGCTTAGC----靶序列

----TCGAATCG----probe

ABC

12345檢測(cè)檢測(cè)缺失和重復(fù)⑴多重PCR（multiplexPCR）一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)特異的PCR產(chǎn)物。常用來(lái)檢測(cè)同一基因的多個(gè)外顯子的缺失突變，或作為PCR擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照。

⑵多重可擴(kuò)增探針雜交(MAPH)

MAPH(multiplex

amplifiablprobehybridization)

是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種用于基因組中DNA拷貝數(shù)檢測(cè)的新技術(shù)。

該方法根據(jù)所檢測(cè)的DNA序列,制備若干具有通用引物的PCR產(chǎn)物作為可擴(kuò)增探針組,與固定在尼龍膜上待測(cè)的基因組DNA雜交。用磁珠回收特異性雜交的探針,通用引物擴(kuò)增后,凝膠電泳分析。多重可擴(kuò)增探針雜交(multiplexamplifiablprobehybridization,MAPH)的原理

(3)多重連接探針擴(kuò)增（muotiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)的原理MLPA是基于MAPH技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，是一種靈敏度很高的相對(duì)定量技術(shù)，利用簡(jiǎn)單的雜和（hybridization）、連接（ligation）及PCR擴(kuò)增（PCRamplication）反應(yīng)，在單一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)最多40個(gè)不同片斷的拷貝數(shù)的變化。MLPA的原理

MLPA和MAPH技術(shù)的應(yīng)用:

遺傳疾病基因缺失、重復(fù)(如SMA、DMD基因等)、基因甲基化檢測(cè)(如Prader-Willisyndrome(PWS)andAngelmansyndrome(AS))、抑癌基因診斷(如Breastcancer、Lungcancer…等)及mRNA分析等。如染色體數(shù)目異常(Trisomy13、18&21)、

至今已發(fā)展出的檢測(cè)探針?lè)N類，已超過(guò)上百種。

141為正常對(duì)照，881患兒外顯子2重復(fù)134患兒外顯子51，52，53，54缺失，135為患者母親，為外顯子51，52，53，54缺失攜帶者，137為正常女性對(duì)照，140為正常男性對(duì)照。四、檢測(cè)特定序列變化----已知突變檢測(cè)適用于：a檢測(cè)特定基因中常出現(xiàn)的突變

b檢測(cè)家系內(nèi)已確定的突變已知點(diǎn)突變檢測(cè)

技術(shù)

1.限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析法.2.ASO探針雜交法.3.等位特異性PCR.4.PCR-SSCP.PCR-DGGE

、PCR-DHPLC5.Sequencing

DNA芯片技術(shù)

(1)限制性酶切圖譜分析法---檢測(cè)已知突變基因較大片段缺失或插入酶切片段長(zhǎng)度改變.基因點(diǎn)突變正好發(fā)生在某限制酶識(shí)別位點(diǎn)酶切點(diǎn)消失或增加酶切片段長(zhǎng)度改變.例1.β地貧-----β珠蛋白部分缺失缺第2內(nèi)含子部分和第3外顯子以及3’端非翻譯序列的部分缺失.

A(正常)

pstIpstI4.4kbE1I1E2I2E35’3’

B(?O—地貧)5’3’3.7kb

pstIpstI

AB4.4kb3.7kbGenomicDNApstI

消化電泳分離

southern轉(zhuǎn)移以?珠蛋白為探針檢測(cè)結(jié)果

A(正常)-----4.4kb雜交帶

B(異常)------3.7kb雜交帶(缺失0.7kb)例2HbSβ鏈第6位AAGATGTT(AT)(Glu)(Vol)

結(jié)果MstI切點(diǎn)消失正常

5’3’

MstI

βAβAβS1.15KbβS

1.35kb1.35kb1.15kb

GenomicDNA經(jīng)MstI酶解后

β珠蛋白基因?yàn)樘结楽outhern印跡雜交結(jié)果

:βAβA----1.15kb,0.2kb

βAβS----1.35kb,1.15kb,0.2kb

βSβS----1.35kb酶切圖譜法檢測(cè)的缺點(diǎn):①.不直接影響酶切點(diǎn)的突變不能檢測(cè)到.②.產(chǎn)生的片段大小太相似也不易被檢測(cè)到.目前還可以特異性擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段,再經(jīng)酶切后電泳檢測(cè)----更簡(jiǎn)便,快速,也能彌補(bǔ)缺點(diǎn)2.(2)ASO探針雜交法---檢測(cè)已知點(diǎn)突變ASO探針(allelespecificoligonucleotideprobe,等位特異性寡核苷酸探針)以點(diǎn)突變?yōu)橹行暮铣?0bp左右的一對(duì)探針與正常序列雜交與異常序列雜交的一對(duì)探針例如:α—抗胰蛋白酶缺乏癥

ASO探針

正常:5’ACCATCGACGAGAAAGGGA3’異常:5’ACCATCGACAAGAAAGGGA3’斑點(diǎn)雜交結(jié)果:

NNNAAA

ab優(yōu)點(diǎn):

1.這種探針可準(zhǔn)確合成.2.擺脫了對(duì)限制酶的依賴性,即不改變酶切位點(diǎn)的突變也能檢測(cè).

缺點(diǎn):

突變位點(diǎn)及性質(zhì)清楚的前提下才能合成ASO探針,只能檢測(cè)已知點(diǎn)突變.(3)等位基因特異性PCR擴(kuò)增

進(jìn)行配對(duì)PCR反應(yīng)，一個(gè)引物在兩個(gè)反應(yīng)體系中相同（通用引物），另一個(gè)引物在兩個(gè)反應(yīng)體系中稍有不同。一個(gè)是正常序列特異引物，另一個(gè)是突變序列特異引物（即引物3’末端最后一個(gè)堿基不同）。（4）三核苷酸重復(fù)疾病的遺傳檢測(cè)Hantington病、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、脆性X染色體等三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展引起的疾病要應(yīng)用PCR擴(kuò)增和Southern分子雜交相結(jié)合的方法。五、基因示蹤前提條件：a明確的臨床診斷

b致病基因已被定位

c有可選擇的遺傳標(biāo)記所謂基因示蹤是以DNA多態(tài)為遺傳標(biāo)記，進(jìn)行連鎖分析，判斷是否得到了帶有缺陷基因的染色體而做出診斷。DNA多態(tài)的概念及類型DNA多態(tài)性(DNApolymorphism):

群體當(dāng)中不同染色體上的基因每幾百個(gè)bp中大約有1個(gè)的比例存在堿基取代,但對(duì)表現(xiàn)型無(wú)改變,這種變異的頻率在群體中占1%以上,這種現(xiàn)象叫DNA多態(tài)性,這種變異以孟德爾共顯性遺傳方式傳遞。1.RFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)第一代遺傳標(biāo)記.

由于DNA多態(tài)性,取代的堿基正好位于某一限制酶切割識(shí)別順序,那么不同個(gè)體,不同染色體上的DNA用相同酶切割時(shí)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段,這種現(xiàn)象叫RFLP.等位片段數(shù)一般是2—3個(gè),即有酶切點(diǎn)和無(wú)酶切點(diǎn).2.VNTR(Variablenumbertandemrepeat,數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù))----第二代遺傳標(biāo)記.大約幾十bp長(zhǎng)的堿基順序在人群中不同染色體上其重復(fù)的拷貝數(shù)不同所產(chǎn)生的多態(tài),一般在非編碼領(lǐng)域中.

小衛(wèi)星DNA(6---20bp)n

微衛(wèi)星DNA(2---6bp)n也稱STR(smalltandemrepeat)例如:FⅧgeneST14(DXS52)位點(diǎn),存在(60bp)n的VNTR.

DMDgene

intron44,45,49,50中存在(CA)n多態(tài).PAHgeneintron3中STR(4bp)n.優(yōu)點(diǎn):群體中等位基因數(shù)目多,雜合子率高---更有意義（可提供信息量高）.PCR-VNTR檢測(cè)PCR-VNTR3.SNPs(singlenucleotidepolymorphism,單核苷酸多態(tài))---第三代遺傳標(biāo)記.基因組中廣泛存在的堿基置換,大約幾百---1kb之中有一個(gè)的比例.連鎖分析舉例PAHgeneMspI/RFLP23kb19kb

MspIMspI19kb23kb基因示蹤的優(yōu)點(diǎn):不一定清楚病因基因的分子基礎(chǔ),只要有基因內(nèi)或近旁DNA多態(tài)標(biāo)記就可以分析.缺點(diǎn):1.必須要有先證者以及家系中相關(guān)各成員的DNA才能分析.2.攜帶者是多態(tài)位點(diǎn)的雜合子時(shí)才能分析.3.連鎖分析要充分認(rèn)識(shí)到由于減數(shù)分裂時(shí)同源染色體交叉互換導(dǎo)致誤診的可能性.六、基因檢測(cè)的應(yīng)用（1）遺傳病-----產(chǎn)前基因診斷.

1）假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是一種嚴(yán)重的神經(jīng)肌肉疾病分為DMD

(Duchennemusculardystrophy杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥）

和BMD(Beckermusculardystrophy)，肌萎縮當(dāng)中占60%.均是由于dystrophin基因突變所致的致死性神經(jīng)肌肉性遺傳病，發(fā)病率為1/3500,XR遺傳.BMD比DMD發(fā)病晚,病情輕.

主要癥狀:通常3---5歲發(fā)病,開始走路不穩(wěn),鴨型步態(tài),上樓梯困難,Gower征陽(yáng)性.進(jìn)行性肌萎縮伴有腓腸肌假性肥大,10多歲下肢癱,一般在20多歲之前死于心衰或呼吸衰竭.生化檢測(cè):血清中磷酸肌酸激酶(CPK)升高.乳酸脫氫酶升高（LDH）,肌紅蛋白（Mb）升高。肌電圖:肌源性改變等.1987年Kunkel等定位克隆DMD基因,定位于Xp21,全長(zhǎng)2400kb,含79個(gè)外顯子,cDNA長(zhǎng)度為14kb.目前研究已知DMD的55%---65%是由于DMD基因不同區(qū)段的缺失,缺失發(fā)生熱點(diǎn)區(qū)DMD基因5’端外顯子(2----19)

外顯子44---52區(qū)域，基因重復(fù)占5%～10%,點(diǎn)突變占25%左右。其中基因缺失為主要突變類型。

Dystrophin基因及蛋白

直接檢測(cè)基因突變:檢測(cè)DMD基因缺失（重復(fù)）突變

①應(yīng)用多重PCR(multiplexPCR)檢測(cè)缺失,18對(duì)引物(9*2)-----98%缺失能檢測(cè)到.

②多重連接探針擴(kuò)增（muotiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)

檢測(cè)DMD基因點(diǎn)突變

應(yīng)用

PCR----DHPLCPCR----SSCPPCR----DGGESequencing等技術(shù)多重PCR檢測(cè)缺失Duchenne/Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD/BMD)方法:根據(jù)dystrophin基因缺失的分布設(shè)計(jì)12對(duì)引物,分成3組第1組:為外顯子19、43、45、34引物第2組：為外顯子51、12、50、53引物第3組：為外顯子48、17、8、52引物分別對(duì)患者基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，每次擴(kuò)增均同時(shí)設(shè)正常對(duì)照。1:DL2000marker;2:正常對(duì)照(第1組引物);3.4:檢出外顯子19的先證者和胎兒:5:正常對(duì)照(第2組引物);6.7:檢出外顯子51的先證者和胎兒;8:正常對(duì)照(第3組引物);9.10:檢出外顯子48的先證者和胎兒.134患兒外顯子51，52，53，54缺失，135為患者母親，為外顯子51，52，53，54缺失攜帶者，137為正常女性對(duì)照，140為正常男性對(duì)照。多重連接探針擴(kuò)增(MLPA)檢測(cè)Dystrophin

基因第47外顯子DHPLC檢測(cè)結(jié)果左側(cè)為無(wú)關(guān)個(gè)體第47外顯子的正常峰形右側(cè)為DMD患者13號(hào)樣本第47外顯子的突變峰形。

基因示蹤---連鎖分析

RFLP連鎖分析

(CA)n連鎖分析---DMD基因5’端、3’端以及內(nèi)含子

1,44,45,49,50,54中的(CA)n多態(tài)進(jìn)行單體型（haplotype)

連鎖分析.

該方法能同時(shí)進(jìn)行缺失檢測(cè).2）甲型血友病(HemophiliaA)

FⅧ因子遺傳性缺陷所致的凝血障礙性出血性疾病.發(fā)病率為男性的1/5千----1/1萬(wàn),XR.

癥狀:自然或輕微外傷后出血不止.

皮下,關(guān)節(jié),肌肉出血----關(guān)節(jié)強(qiáng)直,勞動(dòng)力喪失。顱內(nèi)出血可危及生命。

根據(jù)血漿中FⅧ濃度可分為輕,中,重度.

診斷,治療:血漿代用品分離的FⅧ因子基因工程產(chǎn)品FⅧ因子基因治療FⅧ基因于1984年克隆并定位于Xq28,全長(zhǎng)186kb,含26個(gè)外顯子,25個(gè)內(nèi)含子,mRNA全長(zhǎng)為9kb,編碼2351個(gè)氨基酸.由于致病基因突變類型復(fù)雜多樣,且突變位點(diǎn)不集中------直接診斷受限制.PCR-DGGE

PCR-DHPLC22內(nèi)含子倒位點(diǎn)突變插入缺失重排FVIII基因的各種突變甲型血友病LD-PCR(longdistancePCR)、I-PCR(inversionPCR)FVIII基因突變目前常用基因診斷方法

我們的方案:先檢測(cè)SRY,ZFY/ZFX基因,診斷性別后直接檢測(cè)i22的倒位

間接診斷——連鎖分析

1.首先ST14(DXS52)位點(diǎn)的VNTR多態(tài).2.FⅧgeneintron18中的BclI/RFLP.3.FⅧgeneintron22中的XbaI/RFLP.4.FⅧgeneintron13中的(CA)n多態(tài).

BBF8A3F8A2F8A1QPF8A1QPBF8A3F8A2BQPBBLD-PCR4—λ-hindⅢmarker1、2、5、8、9、12—22內(nèi)含子倒文突變陽(yáng)性6、7、10、11—22內(nèi)含子倒位突變陰性3—22內(nèi)含子倒位攜帶者IU460ID487bp27正常B559bp倒位BIUED99460倒位區(qū)間BCL-Ⅰ酶切區(qū)間EDIDIUI-PCR1-DL2000marker2、3、4、5—22內(nèi)含子倒位突變陽(yáng)性6、7、8—22內(nèi)含子倒位突變陰性9—22內(nèi)含子倒位突變攜帶者孕婦10—為正常胎兒3）苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)

由于苯丙氨酸羥化酶(phenylalanin

hydroxyrase,PAH)遺傳性缺陷所致的遺傳性氨基酸代謝病,發(fā)病率為1/16500,AR遺傳.臨床表現(xiàn):智力低下黑色素形成障礙尿有特殊氨味診斷,治療PAH基因于1983年定位于12q24,全長(zhǎng)85kb,含13個(gè)外顯子,mRNA全長(zhǎng)2.4kb,編碼451個(gè)氨基酸.PAH基因缺陷----以點(diǎn)突變?yōu)橹?而且1/3點(diǎn)突變集中于外顯子7,另外在外顯子6,11,12中也較集中.PKU基因診斷策略:1.應(yīng)用PCR—SSCP,PCR—DGGE技術(shù)檢測(cè)外顯子第7,6,12的點(diǎn)突變.2.應(yīng)用內(nèi)含子3的STR多態(tài)為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析.6%DGGE檢測(cè)家系成員PAH基因外顯子6的電泳圖：Ⅱ1Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ2

ⅠⅡ121N？

4）脊髓性肌萎縮（Spinalmuscularatrophy,SMA）發(fā)病率：1/5000～1/10000

攜帶者率：1/35～1/50

致死性：居致死性常染色體隱性遺傳病的第2位臨床分型：四型臨床表現(xiàn)：進(jìn)行性、對(duì)稱性肌萎縮和肌張力減低治療方法：尚未有效治療方法脊髓性肌萎縮癥的相關(guān)基因1990年Brzustowicz等將SMA基因定位于5q11.2-13.3，在這一區(qū)域先后確定了4個(gè)與SMA有關(guān)的基因。這四個(gè)基因在靠近著絲粒及端粒側(cè)各有一個(gè)拷貝，在5q上宛如鏡中成像一樣排列，其中靠近著絲粒的為假基因，靠近端粒側(cè)的為功能基因。SMN基因?yàn)橹饕虏』?，其余均為修飾基因。SMN

基因SMN基因全長(zhǎng)20kb，8個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.7kb，編碼蛋白含有294個(gè)氨基酸。SMN

基因含有兩個(gè)拷貝：SMN1、SMN2。SMN1基因?yàn)橹饕虏』颍?4%的SMA患者SMN1基因純合型缺失，6%SMA患者可能是SMN1基因內(nèi)的微缺失，點(diǎn)突變等引起。對(duì)SMA進(jìn)行診斷的一個(gè)重要方法就是檢測(cè)SMN1是否純合缺失。Exon1,2a,2b,3-6Intron6Exon8Intron7Exon7SMN1SMN2GGGGCAAAATSMN1與SMN2之間的核苷酸差異

-----------AGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATT

TTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTG

TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATAT

AAAGCTATCTATATATAGCTATCTATATCT

ATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTT

TCCTTACAGGGTTTC▼AAACAAAATCAAAAAGAAGGAAGG-①

P15‘-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3’

-----------AGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATT

TTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTG

TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATAT

AAAGCTATCTATATATAGCTATCTATATCT

ATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTT

TCCTTACAGGGTTTT▼AAACAAAATCAA

AAAGAAGGAAGG-②

P23-TTTGTTTTAGTTTTTCTTCCTTCC-5‘

①為SMN1的7號(hào)外顯子序列;②為SMN2的7號(hào)外顯子序列;Pl:正向引物;P2:反向錯(cuò)配引物，其3’端第二個(gè)堿基為引入的錯(cuò)配堿基(C更替為T);斜體:代表因錯(cuò)配引物而產(chǎn)生的與實(shí)際SMN基因7號(hào)外顯子的堿基差異，實(shí)際上此位置為G;下劃線:代表SMN1和SMN2的7號(hào)外顯子密碼子280上的單堿基差異(T->C);三角號(hào):代表DraI酶切位點(diǎn);擴(kuò)增后兩個(gè)片段長(zhǎng)度均為187bp，DraI酶切后SMN1基因產(chǎn)生187bp，SMN2基因產(chǎn)生164bp片斷。錯(cuò)配PCR-RFLP

檢測(cè)結(jié)果1、4：患者父母；2：患者；3：受累