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課題2土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、基礎(chǔ)知識:1、尿素的利用尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。土壤中細(xì)菌將其分解為NH3才能被植物吸收利用。2、土壤中的細(xì)菌能利用尿素的原因:土壤中的尿素分解菌菌能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3再通過平板劃線法或稀釋涂布平板法對目的菌進(jìn)行分離和純化。3、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理:
利用選擇培養(yǎng)基,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等),促進(jìn)目的菌株的生長,同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。15.0g瓊脂1.0g尿素(唯一N源)10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNa2HPO41.4gKH2PO4篩選尿素分解菌的選擇培養(yǎng)基:(下列物質(zhì)溶解后,定容至1000mL)4.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目:不能區(qū)分死菌與活菌;不適于具有運(yùn)動性的細(xì)菌的計(jì)數(shù);需要較高的細(xì)菌濃度;顯微鏡下難以觀察個(gè)體小的細(xì)菌;缺點(diǎn):(1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)(2)間接計(jì)數(shù)(1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)2.間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)⑴原理:在稀釋度足夠高時(shí),微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的,即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)細(xì)胞。⑵常用方法:稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)=(C÷V)×M其中,C代表某一稀釋度下平板上生長的菌落的平均數(shù),V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml),M代表稀釋倍數(shù)。計(jì)算公式:每克樣品中的菌株數(shù)=(C÷V)×M某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106
的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234,那么每克樣品中的菌落數(shù)是(涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1ml)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確,一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果更接近真實(shí)值可將同一稀釋度的土壤稀釋液涂布到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中,并求平均值。③由于菌落間有粘連,因此統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比實(shí)際的活菌數(shù)低。二、實(shí)驗(yàn)過程
(一)配制土壤溶液
1、土壤取樣:鏟去表層土取樣。2、將10g土樣溶于90mL無菌水,制成101的稀釋液。
(四)菌落鑒定(一)配制土壤溶液(二)系列稀釋(三)涂布平板與培養(yǎng)、觀察(二)樣品稀釋(酒精燈火焰旁進(jìn)行)(1)測細(xì)菌數(shù):一般用104、105、106稀釋液(2)測放線菌:一般用103、104、105稀釋液(3)測真菌數(shù):一般用102、103、104稀釋液原則:確保平板上的菌落數(shù)在30~300之間。(三)涂布平板與培養(yǎng)、觀察1、涂布:用適當(dāng)?shù)南♂屢鹤鐾坎计桨澹ɑ鹧媾裕?、培養(yǎng):細(xì)菌:30~37℃,1~2d;
放線菌:25~28℃,5~7d;
霉菌:25~28℃,3~4d.3、觀察:a.每24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對象,防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而遺漏菌落。
(四)鑒定--鑒別培養(yǎng)基(不影響微生物的生存)
鑒定尿素分解菌的培養(yǎng)基---酚紅培養(yǎng)基
原理:脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅CO(N
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