高效液相色譜的特點(diǎn)與儀器

第二章

高效液相色譜法一、高效液相色譜儀instrumentof

HPLC二、高效液相色譜法的特點(diǎn)

featureofHPLC三、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC第一節(jié)

高效液相色譜的特點(diǎn)與儀器highperformanceliquid

chromatographfeatureandinstrumentof

HPLC2023/2/5一、液相色譜儀器（

highperformanceliquidchromatograph）2023/2/5WatersLC26952023/2/5IC4500i2023/2/51.分離效能高GC分離效能較高，n=103塔板/米，HPLC可達(dá)到5×103~3×104

塔板/米，可使用較短的柱子。二、高效液相色譜法的特點(diǎn)2.選擇性高HPLC柱效高，流動相可以控制和改善分離的選擇性。3.檢測靈敏度高HPLC廣泛采用高靈敏度檢測器，如UV（10-9g/mL），熒光檢測器（10-11g/mL）。HPLC的優(yōu)點(diǎn)2023/2/52023/2/54.分析速度快HPLC載液流速可達(dá)1~10ml/min，完成一個樣品分析僅需幾分鐘到幾十分鐘。5.應(yīng)用范圍廣HPLC法不受樣品沸點(diǎn)、揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性限制，適于分析生物大分子、離子型化合物、不穩(wěn)定的天然物及各種高分子化合物。原則上相對分子量大于400的有機(jī)物都可用HPLC法分析。2023/2/5分析成本高，宜引起污染。缺少高靈敏度的通用型檢測器。不能替代GC完成沸程范圍寬的石油產(chǎn)品的分析。操作較GC復(fù)雜。HPLC的局限性2023/2/5實(shí)際應(yīng)用中，凡是能用GC分析的樣品一般不用HPLC，因?yàn)镚C更快，更靈敏，更方便，且耗費(fèi)較低。

HPLC與GC比較氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)幾乎可分析各種物質(zhì)不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析可用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效色譜柱不能很長、柱效不會很高有很靈敏檢測器和較靈敏的通用檢測器沒有較靈敏的通用檢測器流動相為氣體，無毒、易于處理流動相有毒、費(fèi)用較高運(yùn)行和操作容易運(yùn)行和操作較氣相難儀器制造難度較小儀器制造難度較大2023/2/52023/2/5三、流程及主要部件

高效液相色譜儀的主要部件：儲液罐、高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測器、記錄儀和數(shù)據(jù)處理裝置。工作流程2023/2/52023/2/5一、儲液罐及流動相的脫氣1.儲液罐溶劑在放人儲液罐之前必須經(jīng)過0.45μm濾膜過濾：除去溶劑中的機(jī)械雜質(zhì)，以防輸液管道或進(jìn)樣閥產(chǎn)生阻塞現(xiàn)象。儲液罐的材料應(yīng)耐腐蝕：常用玻璃、氟塑料或PEEK塑料，容積約為0.5~2.0L。儲液罐放置位置要高于泵體：以保持一定的輸液靜壓差。使用過程儲液罐應(yīng)密閉：防溶劑蒸發(fā)引起流動相組成變化，還可防止空氣中O2、CO2重新溶于已脫氣的流動相中。2023/2/52023/2/52．流動相脫氣

除去其中溶解氣體，防止流動相由柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡，而增加基線噪聲。使用熒光檢測器，溶解在流動相中的氧氣，會造成熒光猝滅。還會導(dǎo)致樣品中某些組分被氧化或會使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。流動相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理2023/2/52023/2/5吹氦脫氣法，在0.1MPa下，以約60mL/min流速通入流動相10~15min。此法適用于所有的溶劑，脫氣效果較好，但價格較貴。加熱回流法，此法的脫氣效果較好。抽真空脫氣法，用微型真空泵除去溶解氣體，降壓至0.05~0.70MPa。

超聲波脫氣法，流動相置放于超聲波清洗器中，用超聲波振蕩10~15min。脫氣效果最差。在線真空脫氣法，真空脫氣裝置串接到儲液系統(tǒng)中，使流動相進(jìn)入輸液泵前連續(xù)真空脫氣。此法脫氣效果最好，適于多元溶劑體系。常用的脫氣方法2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5二、高壓輸液泵1.高壓泵性能有足夠的輸出壓力：壓力范圍250~400kg/cm2。輸出流量恒定：流量精密度應(yīng)在1%，無脈動。流量范圍寬：分析儀器應(yīng)在0.1

~10.0ml/min。制備儀器1~100ml/min?？谷軇┑母g：常用不銹鋼和PEEK塑料。泵死體積要??；以便迅速更換溶劑和梯度洗提。2023/2/52023/2/5

2.高壓泵分類：恒流泵：輸出流量恒定，與柱引起阻力無關(guān)。恒壓泵：輸出壓力恒定，與柱引起阻力無關(guān)。(1)恒流泵：常用往復(fù)式柱塞泵和注射泵。

特點(diǎn)：流量恒定，液腔體積小（0.1ml），更換溶劑和梯度洗提方便，但有脈動，應(yīng)用廣泛。2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5(2)恒壓泵：常用氣動泵根據(jù)壓力傳導(dǎo)原理設(shè)計(jì)的，即P1.SA=P2.SBP1低壓，推動大面積SA，則在小面積SB活塞輸出大壓力P2。

特點(diǎn)：壓力恒定，無脈動，液腔體積較大，更換流動相不方便。當(dāng)泵的負(fù)荷阻力小時可提供大的輸出流量，適于勻槳法填裝柱子。2023/2/52023/2/53．梯度洗脫裝置梯度洗提：在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性。通過載液極性改變來改變分離因素，改善分離效果、縮短分析時間、改善峰形，提高分析精度。

高壓梯度（內(nèi)梯度）兩臺高壓泵，將兩種不同極性溶劑按一定比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5低壓梯度（外梯度）:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5三、進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)；通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置；特點(diǎn)：耐高壓，進(jìn)樣的重現(xiàn)性好，易于自動化，易造成色譜峰柱前擴(kuò)寬。

2023/2/52023/2/5裝入狀態(tài)出口進(jìn)樣狀態(tài)采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱三、進(jìn)樣裝置2023/2/52023/2/5四、高效分離柱發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

柱材：一般采用不銹鋼管和PEEK塑料。柱型及尺寸：一般采用管內(nèi)徑1～6

mm，柱長5～40

cm直型柱，標(biāo)準(zhǔn)柱型φ3.9或4.6mm，L15、30cm。填料粒度：5~10

μm，柱效5000～10000

，

3~5

μm，L5~10cm。

2023/2/52023/2/5五、液相色譜檢測器理想的HPLC檢測器應(yīng)具備的特性靈敏度高；對所有溶質(zhì)都有快速響應(yīng)；響應(yīng)對流動相流量和溫度變化不敏感；線性范圍寬；不引起柱外擴(kuò)散。至今沒有一種檢測器完全具備。常用的檢測器UVD；RID；ECD；FLD。2023/2/52023/2/5⑴紫外檢測器

溶質(zhì)性質(zhì)檢測器。

構(gòu)造：2023/2/5特點(diǎn)：靈敏度高(10-9g/mL），線性范圍寬，易于操作，對流動相的流速和溫度變化不敏感，適用于梯度洗脫。應(yīng)用：HPLC中使用最為廣泛?；诒粶y組分對紫外光的選擇性吸收，其吸光度與試樣中組分濃度成正比，檢測原理：即

A∝C。2023/2/52023/2/5①

無組分進(jìn)入時，測量池和參比池只通過流動相，光電管接受的輻射強(qiáng)度相等，無信號輸出。②組分進(jìn)入時，其吸收一定紫外光，光電管接受到輻射強(qiáng)度不等，有信號輸出。2023/2/52023/2/5（2）

光電二極管陣列檢測器（PDAD）二級管陣列檢測器是UV檢測器的重要進(jìn)展，光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理。與普通UVD的區(qū)別進(jìn)入檢測器流通池的不再是單色光；獲得的檢測信號不是單一波長上的，而是全部紫外光波長上的信號?？商峁┙M分的光譜信息，利于定性分析。2023/2/52023/2/5檢測原理：光源發(fā)出的輻射（氘燈）→吸收池→光柵（全息）→二級管陣列檢測器，并用電子學(xué)方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)采集數(shù)據(jù)→可得三維色譜圖－光譜圖2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5特點(diǎn)：最大優(yōu)點(diǎn)是同時獲得吸收值是保留時間和波長函數(shù)的三維圖?？衫蒙V保留值規(guī)律及光譜特征吸收曲線綜合進(jìn)行定性分析?？蓪γ總€色譜峰的指定位置（峰前沿、頂、尾）進(jìn)行光譜比較，以判斷色譜峰的純度及分離情況。目前靈敏度不及UVD。2023/2/52023/2/5

整體性質(zhì)檢測器，普及程度僅次于UVD。（3）示差折光檢測器（RID）

檢測原理：通過連續(xù)測定參比流通池中和樣品流通池中溶液折射率的差值方法，來測定試樣濃度。

折射率的差值與組分的濃度成正比2023/2/52023/2/5

特點(diǎn)：1.通用型檢測器，幾乎每種物質(zhì)都有各自的折射率都可用差示折光檢測器檢測；2.靈敏度低，可以達(dá)到10-7g/mL；3.對溫度、流量變化敏感；4.不能用于梯度洗脫。2023/2/52023/2/5

檢測原理：

光源發(fā)出紫外光→單色器1→吸收池（光被吸收，激發(fā)組分）產(chǎn)生熒光→單色器2→光電倍增管，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與組分濃度成正比。（4）熒光檢測器（FLD）

熒光檢測