惡性腫瘤的基因治療

惡性腫瘤的基因治療制作人：熊樂聶彬恩重新燃起的希望GeneTherapy

在“全國首屆腫瘤并發(fā)癥介入治療學(xué)術(shù)研討會”上，專家指出，約有80%-90%的病人死于腫瘤并發(fā)癥，而非腫瘤本身。據(jù)專家介紹，腫瘤并發(fā)癥是指在自然病程發(fā)展過程中，腫瘤發(fā)生侵犯、轉(zhuǎn)移到某些臟器，或者是在治療過程中因手術(shù)、放化療而難以避免所產(chǎn)生的一系列綜合病癥。腫瘤并發(fā)癥對患者的生命、生活質(zhì)量均會產(chǎn)生不同程度的影響，嚴(yán)重的并發(fā)癥是腫瘤患者的主要死因。專家強(qiáng)調(diào)，在全力針對腫瘤的治療過程中，切不可忽視腫瘤并發(fā)癥的治療目前研究表明，腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫攻擊的可能原因包括腫瘤的抗原調(diào)變和異質(zhì)性、瘤細(xì)胞的MHC抗原和共刺激分子表達(dá)不足、APC功能缺陷、局部細(xì)胞因子缺乏以及游離的免疫抑制性細(xì)胞或分子在局部濃聚等，這多種因素最終造成腫瘤局部處于深度的免疫抑制狀態(tài)，免疫效應(yīng)細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上都不足以激發(fā)起有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，試圖逆轉(zhuǎn)腫瘤局部的免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)原先呈低下狀態(tài)的腫瘤免疫原性，提高局部活化的免疫效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，以激發(fā)起強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)，可能是機(jī)體得以排斥腫瘤的有效手段，這也是目前腫瘤免疫（生物）治療的一個主要目的以過繼免疫療法為基礎(chǔ)將細(xì)胞因子基因?qū)雽?dǎo)入抗腫瘤的免疫效應(yīng)細(xì)胞，回輸體內(nèi)，提高局部細(xì)胞因子的濃度，提高其抗腫瘤的活性，從而更有效的激活機(jī)體抗腫瘤免疫功能常見的有CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)、CIK(細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)、NK(自然殺傷細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、LAK(淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)和TIL(腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞日本watanabe實(shí)驗(yàn)室將ifn-v基因轉(zhuǎn)到CTL其腫瘤殺傷活性提高2-3倍，在體內(nèi)抑癌效果明顯優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因的CTL一：細(xì)胞因子基因?qū)т浫朊庖咝?yīng)細(xì)胞的基因治療以主動免疫療法為主，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞因子后，其MHC抗原分子表達(dá)能力增強(qiáng)，促使多種免疫細(xì)胞在腫瘤局部浸潤從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫二：細(xì)胞因子基因?qū)т浫肽[瘤細(xì)胞的基因治療在1993年由nabel首先應(yīng)用于臨床，他們將用脂質(zhì)體包埋直接注射到5例HLA-B7陰性的黑色素瘤患者瘤內(nèi)，患者的CTL活性明顯提高，腫瘤不同程度的縮小，其中一名患者腫瘤完全消失三：導(dǎo)入MHC抗原基因的腫瘤基因治療利用反義核酸技術(shù)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上阻斷腫瘤細(xì)胞中異?；虻谋磉_(dá)，從而引起細(xì)胞的表型逆轉(zhuǎn)或凋亡四：導(dǎo)入原癌基因和生長因子的反義基因反義核酸第一類將特異的反義基因重組到表達(dá)的載體上導(dǎo)入到靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出反義RNA形成雙鏈RNA阻斷mRNA第二類是人工合成寡聚脫氧核糖核苷酸，經(jīng)化學(xué)修飾導(dǎo)入細(xì)胞與mRNA結(jié)合，形成RNA-DNA雜鏈或核苷酸三聚體，影響基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯第三類是特異的核酶根據(jù)抑癌基因設(shè)計出特異的“錘頭”或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，它能夠催化切割或降解異常表達(dá)的mRNA阻斷基因的翻譯1：起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。證據(jù)表明；一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出RNAi分之生物學(xué)機(jī)制2：RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.RNAi在腫瘤治療中的意義ras基因包括K-ras、H-ras、N-ras,是鳥苷酸結(jié)合蛋白,對細(xì)胞的繁殖、分化和細(xì)胞生存起調(diào)控作用。ras基因突變可使之處于長期激活GTP結(jié)合狀態(tài),易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。K-ras基因在人類腫瘤中最普遍活化狀態(tài)的致癌基因，在腫瘤組織中的突變率30-50%，在胰腺癌中高達(dá)85%。突變的Ras基因與正常細(xì)胞中的野生型ras基因通常只有一個堿基的不同，但由于RNAi的高度特異性，可以針對腫瘤細(xì)胞中突變的ras基因產(chǎn)生抑制作用，而對正常細(xì)胞的野生型ras不產(chǎn)生抑制作用。

最近Li-MoChen等報道建立K-rasV12突變基因的siRNA腺病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Panc-1胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性表型。WeiWang等通過構(gòu)建K-ras基因的siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassette,SEC)成功抑制胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2的K-ras表達(dá)。Fleming等報道，利用化學(xué)合成anti-K-ras-siRNA抑制了PANC-1和MaiPaca-2胰腺癌細(xì)胞K-ras的表達(dá)，并觀測到集落形成能力、細(xì)胞增殖能力和侵襲能力降低、凋亡增加，與VEGF）和血小板反應(yīng)素（thrombspondin-1，TSP-1）基因和c-myc的下游調(diào)控元件、與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucosuetransporter，GLUT-1）基因表達(dá)變化。

癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6（CEARAM6）是免疫球蛋白超家族的成員，在許多腫瘤中都有表達(dá)，對腫瘤的形成、抵抗“失巢凋亡”（anoikis：正常內(nèi)皮細(xì)胞或表皮細(xì)胞黏附不適宜的基質(zhì)時引起細(xì)胞凋亡的一種現(xiàn)象）和形成轉(zhuǎn)移起到重要作用。DuxburyMS等通過化學(xué)合成anti-CEARAM6-siRNA抑制失巢凋亡高抵抗性MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞株的CEARAM6的表達(dá)，觀察到失巢凋亡抵抗性的減弱以及腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)、外模型中轉(zhuǎn)移能力的降低。他們還分別利用逆轉(zhuǎn)錄病毒siRNA表達(dá)載體和化學(xué)合成的方法介導(dǎo)了對CEARAM6基因高表達(dá)BXPC3胰腺癌細(xì)胞株CEARAM6基因的敲減,觀測到腫瘤細(xì)胞侵襲能力降低、轉(zhuǎn)移瘤生成能力下降，進(jìn)一步證明了CEARAM6基因在腫瘤形成、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，為腫瘤的RNAi治療提供了作用靶點(diǎn)。

應(yīng)用反義技術(shù)進(jìn)行腫瘤基因治療最常用的靶基因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及編碼端粒酶基因，或端粒酶的RNA部分。

抑癌基因是抗腫瘤基因治療中一類極為重要的目的基因，將這類基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物通過復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)或活化代謝機(jī)制，能抑制腫瘤的惡性生長，甚至可導(dǎo)致癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。雖然腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多步驟形成的過程，但在這些過程中某種癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了關(guān)鍵性的作用。五：恢復(fù)和增強(qiáng)抑癌基因的功能——引入抑癌基因用基因替代等方法恢復(fù)或增強(qiáng)抑癌基因雜合性的缺失，將某些含有抑癌基因的染色體片斷或整條染色體臂導(dǎo)入那些已知或疑有抑癌基因缺失的腫瘤細(xì)胞或荷瘤動物體內(nèi)，以消除腫瘤細(xì)胞的惡性表型和在體內(nèi)致癌性，從而達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞異常生長的目的?；蛑委熀兔庖叩陌刑禺愋苑肿又委熞堰M(jìn)入臨床研究階段。如通過載有野生型P53的腺病毒載體進(jìn)行瘤體內(nèi)注射。這種用病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤抑制基因治療方法代表了癌癥治療的策略之一。用腫瘤抑制基因如P53、Rb治療因那些有這類基因突變的腫瘤是有價值的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)抑癌基因?qū)盒阅[瘤特征的影響有：轉(zhuǎn)導(dǎo)WT、p53能使結(jié)腸癌、骨肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腺癌增殖降低；轉(zhuǎn)導(dǎo)Rb基因能使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌增殖降低；轉(zhuǎn)導(dǎo)wT-1能使裸鼠體內(nèi)wilms’瘤形成下降；轉(zhuǎn)導(dǎo)NF1能使神經(jīng)纖維瘤病病灶減少；增加p16基因能使裸鼠體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成減少。

在實(shí)體腫瘤中抑癌基因P53分子對由化療引起的DNA損傷有重要的作用,可引起細(xì)胞周期停滯與促使細(xì)胞凋亡，在食道癌研究中已獲療效。自從1994年Okamato等構(gòu)建含有p16INK4cDNA的表達(dá)載體pCMV-p16，成功地轉(zhuǎn)染p16INK4基因缺失的肺癌細(xì)胞系Calu-6和卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3，抑制了瘤細(xì)胞株的集落形成率，并使瘤細(xì)胞的繼續(xù)生長得到控制。此后，在頭頸部癌、卵巢癌中用腺病毒介導(dǎo)野生型P53去消除P53的突變，取得一定的療效。

雖然目前世界上腫瘤基因治療是基因治療研究的熱點(diǎn)，但是基因治療作為腫瘤治療的手段尚很不成熟。首先腫瘤的發(fā)生涉及很多基因的改變，很難想象只針對個別基因進(jìn)行基因治療就能徹底治愈腫瘤。另外，