常用分子生物學(xué)試劑的選擇-中文

常用分子生物學(xué)試劑的選擇趙秋偉用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶如何選擇最合適的限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能

主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈細(xì)菌的限制與修飾作用

hsd

R：編碼限制性核酸內(nèi)切酶

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M：編碼限制性甲基化酶

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S：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)主要特性I型II型III型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)異源三聚體多功能同源二聚體異源二聚體距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列TGAN8TGCTAACN6GTGC距識(shí)別序列下游24-26bp處識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割GAGCC限制性核酸內(nèi)切酶的類型限制性核酸內(nèi)切酶單功能雙功能ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶屬名種名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株HindIII同一菌株中含多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶,表示在該菌株中發(fā)現(xiàn)這種酶的先后次序。限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)EcoRI的切割位點(diǎn)EcoRI的識(shí)別序列5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI等產(chǎn)生的5’粘性末端

5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’OHPOHP退火4-7℃PstI等產(chǎn)生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’

…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHPOHPPvuII等產(chǎn)生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間措施：DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、

BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素星號(hào)活性在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,也能切割一些與其特異識(shí)別序列類似的序列。在酶的名稱右上角加一個(gè)星號(hào)(*)表示,如EcoRⅠ*。必須采用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)步驟,堅(jiān)持應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。同裂酶(isoschizomer)或異源同工酶:不同來(lái)源的限制酶可切割同一靶序列同尾酶(isocaudiners)：來(lái)源不同、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的酶。遠(yuǎn)距離裂解酶(distantcleavage)：識(shí)別位點(diǎn)與切割位置不一致可變酶：識(shí)別序列中的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸是可變的Subset酶：一種酶的識(shí)別序列包含于另一些酶的識(shí)別序列之中

酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)價(jià)格昂貴的酶決不能用水稀釋,以免變性失活。預(yù)先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復(fù)凍融。使用無(wú)菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過(guò)總體積的10％,否則酶液中的甘油會(huì)抑制酶活性。

常用內(nèi)切酶的單位價(jià)格比較

產(chǎn)品名稱公司規(guī)格價(jià)格單位價(jià)格BamHIN50002800.056T20001200.06P25002600.104BglIIN10002800.28T5001200.24P5002280.456DpnIN5003100.62T

P2003841.9175HindIIIN50002800.056T30001200.04P50001560.03NdeIN20003100.115T4002000.5P5007411.482如何選擇最合適的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PCR實(shí)驗(yàn)的不同需求DNA聚合酶的特性純度穩(wěn)定性酶活性PCR實(shí)驗(yàn)的不同需求長(zhǎng)片段擴(kuò)增PCR試劑盒

擴(kuò)增效率

保真性

特異性基因組擴(kuò)增、RT-PCR基因篩選、測(cè)序、基因克隆復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu)）構(gòu)建基因圖譜、測(cè)序、分子遺傳學(xué)復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)模基因檢測(cè)特異性－熱啟動(dòng)Taq酶原理

蠟封抗體抑制化學(xué)修飾特點(diǎn)

避免非特異性擴(kuò)增提高PCR反應(yīng)的特異性用途

基因組擴(kuò)增

RT-PCR－熱啟動(dòng)Taq酶特異性產(chǎn)品類型產(chǎn)品名稱產(chǎn)品性能化學(xué)修飾天為時(shí)代:HotStart

Taq

Roche:FastStart

Taq

Abgene:Thermo-start?DNAPolymerase

Stratagene:SureStart?Taq

大大提高PCR反應(yīng)的特異性化學(xué)修飾不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)抗體抑制

Invitrogen：

AccuPrimeTM

Taq

Platinum?

Taq

TaKaRa：ExTaqTM

HotStart

Version蠟封Promega：TaqBeadTM

HotStart保真性—高保真酶原理用途

表達(dá)基因的克隆基因的定點(diǎn)突變細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析（SNP）

3’-5’核酸外切酶活性降低堿基錯(cuò)配率

保真性—高保真酶產(chǎn)品類型生物公司性能比較PfuDNAPolymerase

天為時(shí)代

Stratagene

Promega在目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐熱聚合酶中,Pfu保真度最高堿基錯(cuò)配率最低PyrobestTM

DNAPolymerase

TaKaRaTliDNAPolymerasePromega高保真＋

高擴(kuò)增效率原理混合酶－高擴(kuò)增效率－3’－5’核酸外切用途超長(zhǎng)片段擴(kuò)增

－測(cè)序

－構(gòu)建基因圖譜復(fù)雜模板擴(kuò)增－GC含量高－二級(jí)結(jié)構(gòu)高保真＋高擴(kuò)增效率特點(diǎn)產(chǎn)品性能高擴(kuò)增效率天為時(shí)代：TaqPlus

TaKaRa：ExTaqTM

復(fù)雜模板擴(kuò)增高保真天為時(shí)代：TaqPlatinum

Invitrogen：Pfx

Platinum

TaqHighFidelity

保真度低于Pfu聚合酶但擴(kuò)增效率較高長(zhǎng)片段擴(kuò)增天為時(shí)代：LongTaq

TaKaRa：LATaq

Invitrogen：Elongase

AmplificaitonSystem

特別適用于保真度較高的超長(zhǎng)片段擴(kuò)增PCR

MasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液dNTPPCR增強(qiáng)劑

PCRMasterMixPCR

MasterMix特點(diǎn)

快速簡(jiǎn)便減少加樣誤差和污染

靈敏度高

可擴(kuò)增低至2個(gè)拷貝的目的模板

特異性強(qiáng)降低PCR反應(yīng)的要求，增強(qiáng)特異性

穩(wěn)定性好長(zhǎng)期放置活性無(wú)改變適用范圍大規(guī)模基因檢測(cè)目的基因拷貝數(shù)極低的樣本

GC含量高,有二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板復(fù)雜基因組樣本可直接檢測(cè)菌落，基因點(diǎn)突變檢測(cè),

或者陽(yáng)性克隆的篩選。如何選擇最合適的DNA修飾酶酶的作用DNA連接酶修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子還可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作輔因子。E.coliDNAligase作用于5’端帶磷酸基團(tuán)的DNA底物NAD+可促進(jìn)該催化反應(yīng)分子克隆使用不多，亦不能連接RNA。用途:cDNA第二鏈合成。T4RNAligase催化單鏈DNA或RNA連接。主要用途是對(duì)RNA進(jìn)行3＇末端標(biāo)記以核酸為底物的水解酶按底物專一性分：RNase、DNase、非專一性核酸酶按作用位點(diǎn)分：內(nèi)切或外切酶5‘-核酸酶或3’-核酸酶常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、綠豆核酸酶、RNaseARNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌體外切核酸酶等。許多核酸酶兼有內(nèi)切和外切活性核酸酶對(duì)核酸末端羥基進(jìn)行磷酸化的酶用途：放射性標(biāo)記DNA鏈的5‘末端，探針標(biāo)記Maxam-Gilbert化學(xué)法的