講基因工程操作程序通用課件

講基因工程操作程序課件目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序的步驟：目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞閱讀與思考1、什么是目的基因？2、獲取目的基因的方法有哪些？其操作過程分別是怎樣的？一、目的基因的獲取1、目的基因概念：主要指的是編碼蛋白質的結構基因。也可以是一些具有調控作用的因子。2、目的基因獲取方法：從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術擴增目的基因化學方法直接人工合成從基因文庫中獲取目的基因基因文庫：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）基因文庫的構建過程基因組文庫限制酶供體細胞的全部DNA大量DNA片段拼接到載體上導入受體細胞擴增基因文庫的構建過程mRNA單鏈DNA

雙鏈DNA逆轉錄cDNA文庫如何從基因文庫中找到所需要的基因？依據(jù)目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因在染色體上的位置基因的轉錄產物mRNA

基因翻譯產物蛋白質等特性。從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術擴增目的基因PCR的全稱：聚合酶鏈式反應PCR的原理：

DNA復制

PCR技術擴增目的基因的前提條件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。模板原料引物酶控制溫度利用PCR技術擴增目的基因——目的基因DNA——四種脫氧核苷酸——如單鏈DNA分子片段——耐熱的DNA聚合酶——PCR儀自動調控PCR的條件：PCR的過程：利用PCR技術擴增目的基因變性(90-95℃)復性(55-60℃)(退火）延伸(70-75℃)用化學方法直接人工合成條件：基因較小，核苷酸序列已知。二、基因表達載體的構建—核心用切目的基因相同的限制性內切酶切割質粒二、基因表達載體的構建—核心二、基因表達載體的構建—核心目的基因二、基因表達載體的構建—核心1、基因表達載體的組成目的基因啟動子:終止子:標記基因、復制原點等一段有特殊結構的DNA片段。位于基因的首端。一段有特殊結構的DNA片段。位于基因的尾端。啟動子的作用：二、基因表達載體的構建—核心終止子作用：使轉錄在所需要的地方停止。標記基因作用：是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來，如青霉素基因。

是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質。二、基因表達載體的構建—核心2、基因表達載體的構建目的：a.使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。b.使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。三、目的基因導入受體細胞

1、什么是轉化？

2、目的基因導入植物細胞常用的方法是什么？具體過程是怎樣的？

3、目的基因導入動物細胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？

4、目的基因導入大腸桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？轉化目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞常用的方法:

農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法農桿菌的特點:a.易感染雙子葉植物和祼子植物。b.具有趨化性。c.Ti質粒上的T-DNA可轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上三、目的基因導入受體細胞三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法的導入過程:構建基因表達載體轉入農桿菌植物細胞導入穩(wěn)定維持和表達２.目的基因導入動物細胞常用的方法:

顯微注射技術操作程序：三、目的基因導入受體細胞a.先提純含目的基因的表達載體b.從動物體內取出卵(受精卵）c.顯微注射儀進行顯微注射d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個體3.目的基因導入微生物細胞原核生物的特點:繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少。大腸桿菌的轉化過程:用Ca2+處理細胞增加細胞壁的透性，與細胞膜無關三、目的基因導入受體細胞→

感受態(tài)細胞重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子四、目的基因的檢測與鑒定1、導入目的基因后需要檢測哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探針？檢測時的DNA探針通過什么原理來檢測目的基因和相應的mRNA？3、利用抗體－抗原雜交檢測的原理是什么？1.目的基因是否插入受體細胞染色體的DNA上目的基因的檢測內容和方法檢測方法:DNA分子雜交技術DNA探針：用放射性同位素等作標記的含有目的基因的DNA片段。四、目的基因的檢測與鑒定DNA分子雜交技術基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標記物。2.目的基因是否轉錄出mRNA目的基因的檢測內容和方法檢測方法:分子雜交技術用DNA探針與mRNA雜交。四、目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測內容和方法檢測方法:抗原—抗體雜交3.目的基因是否翻譯出蛋白質四、目的基因的檢測與鑒定4、個體生物學水平的鑒