生化工程下游技術(shù)-課件-第8章

第八章反膠團(tuán)萃取

第一節(jié)概述

第二節(jié)反膠團(tuán)的構(gòu)造與制備

第三節(jié)反膠團(tuán)萃取原理

第四節(jié)反膠團(tuán)的應(yīng)用

第五節(jié)反膠團(tuán)萃取設(shè)備

第一節(jié)概述傳統(tǒng)的分離方法(如溶劑萃取技術(shù))難以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的提取和分離。其主要原因有兩個(gè)：一是被分離對(duì)象－蛋白質(zhì)等絕大多都不溶于有機(jī)溶劑，若使蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸，也會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性；二是萃取劑問(wèn)題，蛋白質(zhì)分子表面帶有許多電荷，普通的離子締合型萃取劑很難奏效。優(yōu)點(diǎn)：反膠束萃取具有成本低溶劑可反復(fù)使用萃取率和反萃取率都很高反膠束萃取還有可能解決外源蛋白的降解，可用于直接從整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)和酶。反膠團(tuán)萃取技術(shù)在分離蛋白質(zhì)方面的優(yōu)點(diǎn)

（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性；（2）分離、濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過(guò)程簡(jiǎn)便；（3）能解決蛋白質(zhì)（如胞內(nèi)酶）在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問(wèn)題；（4）由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；（5）反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。正膠團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”水非極性的“核”極性“頭”非極性“尾”反膠團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”有機(jī)溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”反膠團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)在疏水性環(huán)境中的形成極性“水核”具有較強(qiáng)的溶解能力。生物大分子由于具有較強(qiáng)的極性，可溶解于極性水核中，防止與外界有機(jī)溶劑接觸，減少變性作用。由于“水核”的尺度效應(yīng)，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，增加其結(jié)構(gòu)的剛性，提高其反應(yīng)性能。具有分子識(shí)別并允許選擇性透過(guò)的半透膜的功能水殼模型蛋白質(zhì)中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳?xì)浠衔锵嘟佑|蛋白質(zhì)被吸附在微膠團(tuán)的“內(nèi)壁”上蛋白質(zhì)被幾個(gè)微膠團(tuán)所溶解，微膠團(tuán)的非極性尾端與蛋白質(zhì)的親脂部分直接作用反膠團(tuán)溶解蛋白質(zhì)的形式第二節(jié)反膠團(tuán)的構(gòu)造與制備一、反膠團(tuán)的構(gòu)造：

向非極性溶劑中加入表面活性劑時(shí)，如表面活性劑的濃度超過(guò)一定的數(shù)值時(shí)，會(huì)在非極性溶劑內(nèi)形成表面活性劑的聚集體。反膠團(tuán)溶液形成的關(guān)鍵:表面活性劑的存在

1、不同表面活性劑聚集體2、表面活性劑

表面活性是由親水憎油的極性基團(tuán)和親油憎水的非極性基團(tuán)兩部分組成的兩性分子(1)陰離子型表面活性劑：AOT（AerosolOT),

其化學(xué)名稱是琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸鈉(2)陽(yáng)離子型表面活性劑：CTAB溴代十烷基三甲銨(3)非離子型表面活性劑AOT具有雙鏈，極性基團(tuán)較小，形成反膠團(tuán)時(shí)無(wú)需添加輔助表面活性劑，所形成的反膠團(tuán)空間較大(半徑170nm)，有利于生物大分子進(jìn)入。AOT

的分子結(jié)構(gòu)，化學(xué)名為丁二酸－2－乙基己基磺酸鈉AOT-異辛烷-水體系：萃取條件：pH8左右，KCl0.2mol/L反萃取條件：pH12左右，KCl1.0mol/L(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴需加入助溶劑，以提高堆砌率[(v/L)/a>1].將陽(yáng)離子表面活性劑如CTAB溶于有機(jī)溶劑形成反膠束時(shí)，與AOT不同，還需加入一定量的助溶劑(助表面活性劑)。這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诮Y(jié)構(gòu)上的差異造成的。(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲銨(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲銨3、反膠團(tuán)的分類1)單一表面活性劑反膠團(tuán)體系：是指在使用時(shí)無(wú)須假如助劑的表面活性劑，具有多條中等長(zhǎng)度的烷基尾和一個(gè)較小的極性頭。

a:陰離子型表面活性劑，如AOT。該體系結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和穩(wěn)定，反膠團(tuán)體積較大，適用于等電點(diǎn)較高的、相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)的分離；

b:陽(yáng)離子型表面活性劑（如CTAB，DAP）等。該體系適用于等電點(diǎn)較低的、相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)的分離；

c:非離子型表面活性劑能形成更大的反膠團(tuán)體系。能分離相對(duì)分子量更大的蛋白質(zhì)，但這類體系容易乳化。2)混合表面活性劑反膠團(tuán)體系：是指兩種或兩種以上表面活性劑構(gòu)成的體系，一般來(lái)說(shuō)，混合表面活性劑反膠團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)有更高的分離效率。3)親和反膠團(tuán)體系：是指除了有組成反膠團(tuán)的表面活性劑以外，還有具有親和特征的助劑，它的親和配基與蛋白質(zhì)有特異的結(jié)合能力，往往極少量親和配基的加入就可使萃取蛋白質(zhì)的選擇性大大提高。二、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備

1、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性：表面活性劑和非極性有機(jī)溶劑的種類、濃度；操作時(shí)體系的溫度、壓力；微小水池中的離子強(qiáng)度等，都會(huì)影響反膠團(tuán)的大小。（1）反膠團(tuán)的臨界膠團(tuán)濃度（CMC）：表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑相中能形成反膠團(tuán)的最小濃度稱為臨界膠團(tuán)濃度。

C水

W=----C表反膠團(tuán)的大小以及反膠團(tuán)內(nèi)微水相的物理化學(xué)性質(zhì)因反膠團(tuán)含水率W的不同而差別很大。如表面活性劑是AOT，則：W＝C水/CAot，W是個(gè)非常重要的參數(shù)，W越大，反膠團(tuán)的半徑越大。

（2）反膠團(tuán)含水率W：W用水和表面活性劑的濃度之比來(lái)定義，即

當(dāng)W

<6-8時(shí)，“水池”中水的其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，疏水性非常強(qiáng)，另外，其冰點(diǎn)通常低于0℃。當(dāng)W

>16（<40)時(shí)，“水池”中的水逐漸接近主體水相粘度，膠團(tuán)內(nèi)也形成二重電荷層，W.max=60，若W值再增大，反膠團(tuán)溶液變渾濁，并開(kāi)始分層。

“水池”中水與普通水的差異：二、反膠團(tuán)的制備：

制備反膠團(tuán)系統(tǒng)一般有以下三種方法：

（1）注入法：將含有蛋白質(zhì)的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑中去，然后進(jìn)行攪拌直到形成透明的溶液為止。

（2）相轉(zhuǎn)移法：把含有表面活性劑的有機(jī)相和含有蛋白質(zhì)的水相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質(zhì)緩慢轉(zhuǎn)入（萃入）有機(jī)相。

（3）溶解法：將含有反膠團(tuán)（W0＝3－30）的有機(jī)溶液與蛋白質(zhì)固體粉末一齊攪拌，使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)中。

第三節(jié)反膠團(tuán)萃取分離原理

宏觀上,反膠團(tuán)萃取，是有機(jī)相－水相間的分配萃取，即與液液萃取在操作上具有相同特征。

。一、原理微觀上，是從主體水相向有機(jī)溶劑相中的反膠團(tuán)微水相中的分配萃取特點(diǎn)：（1）萃取進(jìn)入有機(jī)相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，從而避免了與有機(jī)溶劑相直接接觸而引起的變性，失活。（2）pH、離子強(qiáng)度、表面活性劑濃度等（如表8.1所示）因素會(huì)對(duì)反膠團(tuán)萃取產(chǎn)生影響。通過(guò)對(duì)它們的調(diào)整，對(duì)分離場(chǎng)（反膠團(tuán)）－待分離物質(zhì)（生物大分子等）的相互作用加以控制，能實(shí)現(xiàn)對(duì)目的物質(zhì)高選擇性的萃取和反萃取。（3）反膠團(tuán)中微水相體積最多僅占有機(jī)相的幾個(gè)百分點(diǎn)、所以它同時(shí)也是一個(gè)濃縮操作。二、影響反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的主要因素

（1）水相pH值的影響：

水相的pH是影響反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的最主要因素。

表面活性劑的極性頭是朝向反膠團(tuán)的內(nèi)部，是反膠團(tuán)的內(nèi)壁帶有一定的電荷，而蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，水相的pH值決定了蛋白質(zhì)分子表面可電離基團(tuán)的離子化程度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所帶電荷與反膠團(tuán)內(nèi)所帶電荷的性質(zhì)相反時(shí)，由于靜電引力，可使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到反膠團(tuán)中。相反，當(dāng)水相pH大于等電點(diǎn)時(shí)，由于靜電斥力，使溶入反膠團(tuán)的蛋白質(zhì)反向萃取出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃取。

蛋白質(zhì)的萃取，與蛋白質(zhì)的表面電荷和反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用，以及反膠團(tuán)的大小有關(guān)，所以，任何可以增強(qiáng)這種靜電作用或?qū)е滦纬奢^大的反膠束的因素，都有助于蛋白質(zhì)的萃取。

以表8.2所示的酶、蛋白質(zhì)為例，考察萃取或反萃取時(shí)靜電性相互作用以及pH對(duì)這種作用的影響。

AOT-異辛烷-水體系

例：小分子蛋白質(zhì)

當(dāng)pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)不能溶入膠團(tuán)內(nèi)，但在等電點(diǎn)附近，急速變?yōu)榭扇?。?dāng)pH<pI時(shí)，即在蛋白質(zhì)帶正電荷的pH范圍內(nèi)，它們幾乎完全溶入膠團(tuán)內(nèi)。

不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，pH值對(duì)萃取率的影響有差異性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量增加時(shí)，只有增大(pH-PI)值的絕對(duì)值，相轉(zhuǎn)移才能順利完成

增大(pH-PI)值的絕對(duì)值促進(jìn)相轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量Mr與(pH-pI)絕對(duì)值呈線性關(guān)系（2）水相離子強(qiáng)度的影響：

離子強(qiáng)度對(duì)萃取率的影響主要是由離子對(duì)表面電荷的屏蔽作用所決定的:

a.離子強(qiáng)度增大后，反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠束內(nèi)表面之間的靜電吸引，從而減少蛋白質(zhì)的溶解度b.反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了表面活性劑極性基團(tuán)之間的斥力，使反膠束變小，從而使蛋白質(zhì)不能進(jìn)入其中；c.離子強(qiáng)度增加時(shí)，增大了離子向反膠束內(nèi)“水池”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向，使蛋白質(zhì)從反膠束內(nèi)被鹽析出來(lái)；d.鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，可以改變?nèi)芙庑阅?，鹽的濃度越高，其影響就越大。

添加KCl等無(wú)機(jī)鹽，因離子強(qiáng)度的增加和靜電屏蔽的作用，而使靜電性相互作用變?nèi)?，一般地，萃取率下?/p>

添加KCl等無(wú)機(jī)鹽，對(duì)有機(jī)相具有脫水作用（W0減?。?，使立體性相互(排斥)作用增大，萃取率有下降趨勢(shì)。（3）助表面活性劑的影響：

蛋白質(zhì)的分子量往往很大，超過(guò)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)，使表面活性劑形成的反膠團(tuán)的大小不足以包容大的蛋白質(zhì)，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)萃取，此時(shí)加入一些非離子表面活性劑，使它們插入反膠團(tuán)結(jié)構(gòu)中，就可以增大反膠團(tuán)的尺寸，溶解較大相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。

（4）溶劑體系的影響：

溶劑的性質(zhì)，尤其是極性，對(duì)反膠團(tuán)的形成和大小都有影響，常用的溶劑有：烷烴類（正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷等），有時(shí)也使用助溶劑，如醇類?？梢哉{(diào)節(jié)溶劑體系的極性，改變反膠團(tuán)的大小，增加蛋白質(zhì)的溶解度。（5）表面活性劑種類及濃度的影響選用有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面電荷與反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用和增加反膠束大小的表面活性劑增大表面活性劑的濃度可增加反膠束的數(shù)量，從而增大對(duì)蛋白質(zhì)的溶解能力。但表面活性劑濃度過(guò)高時(shí)，有可能在溶液中形成比較復(fù)雜的聚集體，同時(shí)會(huì)增加反萃取過(guò)程的難度。因此，應(yīng)以蛋白質(zhì)萃取率最大為最佳濃度。（6）溫度的影響溫度的變化對(duì)反膠束系統(tǒng)中的物理化學(xué)性質(zhì)有激烈的影響，增加溫度能夠增加蛋白質(zhì)在有機(jī)相的溶解度，例如增加溫度可使α-胰凝乳蛋白酶進(jìn)入NH4-氯仿相并在轉(zhuǎn)移率上分別增加50％。第四節(jié)反膠團(tuán)萃取的應(yīng)用

一、分離蛋白質(zhì)混合物

第一步：在pH=9和較低的鹽濃度下，核糖核酸酶-a帶負(fù)電荷，不能被反膠團(tuán)萃取，留在水相中，而細(xì)胞色素C和溶菌酶由于都帶正電荷，被萃取到反膠團(tuán)中。第二步：利用提高離子強(qiáng)度，將細(xì)胞色素C反萃到水相中，而溶菌酶仍留在反膠團(tuán)中。第三步：進(jìn)一步提高pH值和離子強(qiáng)度，將溶菌酶反萃到水相中。因此，通過(guò)調(diào)整pH，進(jìn)行正萃取分離，通過(guò)控制KCl濃度，反萃取分離，能獲得較好的分離效果和收率。

二、濃縮α-淀粉酶

使用如圖8.14所示，用2個(gè)混合槽和2個(gè)澄清槽組成連續(xù)萃取/反萃取流程，用TOMAC/0.1%(v)辛醇－異辛烷的反膠團(tuán)體系循環(huán)萃取分離α-淀粉酶，控制第一級(jí)水相中酶濃度在較低水平上，使失活速度很小，將α-淀粉酶濃縮了8倍，酶活力損失約30%。對(duì)該過(guò)程優(yōu)化，在反膠團(tuán)中加入非表面活性劑，以提高分配系數(shù)，同時(shí)加大攪拌速度，以提高傳質(zhì)速率，反萃液中α-淀粉酶的活力回收率為85%，濃縮了17倍。三、直接提取胞內(nèi)酶：

用反膠團(tuán)萃取直接從全發(fā)酵液中提取和純化棕色固氮菌的胞內(nèi)脫氫酶：將全細(xì)胞的懸浮液注入CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）/己醇-辛烷反膠團(tuán)溶液中，完整的細(xì)胞在表面活性劑的作用下，析出酶進(jìn)入反膠團(tuán)的“水池”中，經(jīng)反萃取，可選擇性地回收濃度很高的酶。該技術(shù)不利的一面是細(xì)胞碎片留在反膠團(tuán)中，使得反膠團(tuán)不能循環(huán)利用，但如果能夠便利地回收有機(jī)溶劑和表面活性劑，那么這種細(xì)胞溶解和蛋白質(zhì)萃取相結(jié)合的工藝方法，將成為從細(xì)胞中直接提取蛋白質(zhì)的重要途徑。四、反膠團(tuán)萃取用于蛋白質(zhì)的復(fù)性

反膠團(tuán)萃取的一個(gè)引人注目的應(yīng)用是蛋白質(zhì)的復(fù)性。重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的大部分蛋白質(zhì)，須溶于強(qiáng)變性劑中，以便從細(xì)胞中抽提出來(lái)。除去變性劑，進(jìn)行復(fù)性的過(guò)程通常要在極稀的溶液中進(jìn)行，以避免部分復(fù)性中間體的凝集。利用反膠團(tuán)包裹變性的蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)整系統(tǒng)組成的環(huán)境參數(shù)，使得每個(gè)微膠團(tuán)只包裹一個(gè)蛋白質(zhì)分子，然后改變膠團(tuán)溶液組成進(jìn)行復(fù)性，由于蛋白質(zhì)被單獨(dú)裝在各個(gè)膠團(tuán)中，復(fù)性時(shí)完全不接觸，避免了有害作用，使酶的活性完全恢復(fù)。

五、從植物中提取油和蛋白質(zhì)

用烴類有機(jī)溶劑對(duì)植物種子進(jìn)行反膠團(tuán)萃取，油被直接萃入有機(jī)相，蛋白質(zhì)卻萃入反膠團(tuán)的“水池”中。先用水溶液反萃取得到蛋白質(zhì)，溶液再經(jīng)冷卻使表面活性劑沉淀分離，最后用蒸餾的方法將油和烴類分離。實(shí)驗(yàn)證明該方法相當(dāng)優(yōu)越。

六、反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的過(guò)程開(kāi)發(fā)1、新型反膠團(tuán)體系

AOT不能分離分子量大的蛋白質(zhì)且沾染產(chǎn)品，需選擇更優(yōu)良的表面活性劑。2、蛋白質(zhì)的反萃取目前的回收方法回收率低，對(duì)活性有傷害。3、反膠團(tuán)萃取的工業(yè)化存在問(wèn)題：沾染、工業(yè)放大的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)缺乏、放大模擬的理論模型的建立。第五節(jié)反膠團(tuán)萃取設(shè)備

要實(shí)現(xiàn)反膠團(tuán)萃取的工業(yè)化，關(guān)鍵之一是開(kāi)發(fā)適用于反膠團(tuán)萃取的高效分離設(shè)備1、膜萃取器：膜萃取器有管狀超濾膜和中空纖維膜兩種（1）管狀超濾膜用管狀陶瓷超濾膜截留含有磷脂酶的反膠團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物產(chǎn)品的部分分離。含有磷酯酶的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)泵進(jìn)入到陶瓷超濾膜組件中，磷酯酶被截留在膜內(nèi)，萃余相則返回到反應(yīng)器，從而實(shí)現(xiàn)磷酯酶的分離。（2）中空纖維膜

中空纖維管是另一類被廣泛用于液-液分離的膜萃取器。它具有很大的比表面積，且與反膠團(tuán)技術(shù)相結(jié)合能減少蛋白質(zhì)的失活，是一項(xiàng)很有實(shí)用前景的生物分離技術(shù)。將親和配基（活性色素辛巴藍(lán)）加入到大豆卵磷酯-正已烷系統(tǒng)中，制成親和反膠團(tuán)相，并將此膠團(tuán)相固定于聚丙烯中空纖維膜內(nèi)，從而構(gòu)建起親和反膠團(tuán)萃取膜的分配色譜裝置（AMPC）。2、離心萃取器

反膠團(tuán)溶液-水-蛋白質(zhì)所組成的萃取體系，由于表面活性劑的存在，界面張力低，易乳化。另外，