農(nóng)產(chǎn)品加工貯藏專題論文

農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及其展望，對其在檢測中存在的問題進(jìn)行了分析，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫分析法抗體抗原半抗原抗體抗原結(jié)合物農(nóng)藥殘留TheTechnologyofELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）anditsrspectiveinTheDetectionofPesticideResidueinFruitsandVegetablesAbstractAsaimportantkindofrapiddetection，ELISAplaysancrucialroleinthepesticideresidueoffruitsandvegetables.ThisarticlesimplyintroducestheessentialofELISAandanalysesitsproblemsintheanalysisindetections,italsomakesaperspectivefortheapplicationofELISA.KeyWords：ELISA;Antibody;Antigen;Haptens;Conjugate;PesticideResidue我國作為世界上最大的蔬菜水果生產(chǎn)國和消費(fèi)國，僅09年蔬菜的生產(chǎn)就達(dá)避免，因此農(nóng)藥殘留對人們的健康和環(huán)境的污染構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，能外，還對系統(tǒng)機(jī)能構(gòu)成潛在的危害，甚至?xí)档蜋C(jī)體的免疫功能，表現(xiàn)有致癌、致畸、致突變的作用[1]。對于食品中農(nóng)藥殘留的檢測，除傳統(tǒng)的GC、HPLC、GC—MS、HPLC—MS等方法[2-3]外，免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也越來越深入，其中應(yīng)用最廣的是以固相載體吸附抗原/抗體為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫分析法。理，檢測成本低便于推廣等優(yōu)點(diǎn)，并且能同時(shí)進(jìn)行大批量樣品檢測。在美國，有關(guān)官方機(jī)構(gòu)，如環(huán)境保護(hù)署(EPA)、農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)司(FSIS—USDA)和化學(xué)會(AOAC)已制定了農(nóng)藥殘留免疫學(xué)檢驗(yàn)商品試劑盒評定和認(rèn)可的建議準(zhǔn)則[6-7]，明確了測定結(jié)果的法律效力。特別的，美國化學(xué)會AOAC已將分析與氣相色譜、液相色譜同列為農(nóng)藥殘留的三大支柱技術(shù)。1.疫分析法的原理酶聯(lián)免疫分析法（enzamylinked-immunabsorbedassay）簡稱ELISA，基本原競爭固相抗體結(jié)合位點(diǎn)或固相抗原與未知抗原競爭限定量的標(biāo)記抗體結(jié)。在一定的底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物，使其過分光光度計(jì)測定，從而確定是否存在未知抗原或含量[3]。2.ELISA在農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)用的技術(shù)要點(diǎn)ELISA的核心技術(shù)是抗原抗體的特異性反應(yīng)和酶對底物的催化作用。抗原或抗原結(jié)合后還要能保持對底物的催化作用。2.1半抗原的設(shè)計(jì)合成后才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，而蛋白質(zhì)就是大分子物質(zhì)的最佳選擇。Friei[8]等認(rèn)為一個(gè)理想的半抗原應(yīng)包括待測物的特征結(jié)構(gòu)、便于機(jī)體對特征結(jié)構(gòu)進(jìn)行識別的連接臂及其末端可與蛋白載體進(jìn)行共價(jià)連接的功能基團(tuán)。因出有預(yù)期選擇性和親和性的抗體，因此農(nóng)藥分子或合成分子與載體之間必須有4-6個(gè)C原子的連接臂，使半抗原突出于載體表面，這樣才能容易被機(jī)體識別，生免疫反應(yīng)。而且間隔臂上也不能有特征抗原決定簇。分子的抗體，來對這類農(nóng)藥殘留進(jìn)行測定。蛋白質(zhì)連接的半抗原的數(shù)目對誘發(fā)抗體有一定的影響，一般認(rèn)為20~40個(gè)差[9]。1.2.1直接方法合成人工抗原。農(nóng)藥分子半抗原如果有反應(yīng)功能團(tuán),則可根據(jù)具體情況用適當(dāng)?shù)碾p功能交聯(lián)試劑與交聯(lián)方法使半抗原與載體偶聯(lián)。對于—COOH半抗原,可利用—COOH通（重氮化法或戊二醛法;對于—OH半抗原則可直接與丁二酸酐衍生后再與蛋白質(zhì)交聯(lián);對于—SH半抗原則可通過同源或異源雙功能試劑交聯(lián);而酮基半抗原則常氧乙酸化。1.2.2衍生方法合成人工抗原如果農(nóng)藥分子中不含有反應(yīng)功能團(tuán),則需先通過衍生過程在農(nóng)藥分子內(nèi)產(chǎn)生用的衍生方法,目前比較常用的有以下方法,用與半抗原結(jié)構(gòu)相似的但有反應(yīng)活性商品化學(xué)試劑。適當(dāng)?shù)碾p功能交聯(lián)試劑與交聯(lián)方法使半抗原與載體耦聯(lián)。Aaaa[7-10]2.2載體的選擇(OV對于ELISA中的包被抗原來講，還要和包被板結(jié)合，所以對于蛋白來講，能和包被板緊密結(jié)合，所以選擇蛋白分子作為載體既能提高免疫原性[11-12，了實(shí)驗(yàn)的可行性。在不同離子強(qiáng)度，PH值下，有機(jī)溶劑存在下，都能和半抗原連接，并且在偶聯(lián)后還能保持可溶性的狀態(tài)，因此使用較為廣泛[7]2.3酶標(biāo)農(nóng)藥抗原的合成目合適才能發(fā)揮最大的免疫原性，數(shù)目太多或太少都會使誘發(fā)抗體的能力都很用來連接酶與農(nóng)藥，制備酶標(biāo)農(nóng)藥抗原aaaaaaa[13]2.4抗體的制備白載體相結(jié)合的農(nóng)藥半抗原或者合成半抗原可以直接用來進(jìn)行免疫動等，每間隔一段時(shí)間加強(qiáng)免疫一次，一般六個(gè)月左右可[]技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)aa[15]。2.4.1多克隆抗體（polyclonalantibody）多克隆抗體的制備比較簡單，采用天然抗原（對于農(nóng)藥分子來說直接可以作產(chǎn)成本低、方法簡便、來源廣泛、易于制備等特點(diǎn)，但而且生產(chǎn)數(shù)量也受限制，因此不利于生產(chǎn)大批量商品試劑盒。次免疫的過程中需要加入等量弗氏完全佐劑，增加抗原免疫原性，是動更容易產(chǎn)生抗體。2.4.2雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體（monoclonalantibody）由單一純系細(xì)胞合成的抗體稱為單克隆抗體，其重鏈、輕鏈、獨(dú)特型完全相異性強(qiáng)，可以避免血清學(xué)上的交叉反應(yīng)。在半抗原載體能分泌特異性抗體的細(xì)胞，并測定這些抗體的的效價(jià)，無限增值的功能。相對于多克隆抗體制備技術(shù)來說，單克隆抗體制備過程復(fù)雜，對設(shè)備和技術(shù)用也較高，但是單克隆抗體具備性質(zhì)純、效價(jià)高、特異上有很大應(yīng)用價(jià)值。2.4.3重組抗體(recombinationantibody)達(dá)，篩選和收集?？贵w，對其有6×10-9的親和力，然而，現(xiàn)在對與黃曲霉毒素來說，有關(guān)重組抗道還比較少。就是怎么保持或者改進(jìn)抗體與待測物結(jié)合的能力。[但是還沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。3.ELISA在水果蔬菜農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用ELISA試劑盒可用于果蔬農(nóng)藥殘留檢測，正如本文開始所講，ELISA具有很者不需檢測設(shè)備，樣品前處理程序簡化：液體樣品，果理，可直接取樣檢測；固體食品，如糖果蜜餞等經(jīng)抽提測)，檢驗(yàn)成本低aaaaa[19]，對操作技術(shù)要求低，非常適合于現(xiàn)場應(yīng)用，特別是果蔬之類對新鮮程度要求比較高的農(nóng)產(chǎn)品和食品。ELISA不僅可用來定性篩選，而且也可以用來定量分析，對很多農(nóng)藥的檢測果、蔬菜等還有飲料、啤酒、葡萄酒、魚、肉、豬油、奶、植物油、植物(昆蟲)生長調(diào)節(jié)劑等農(nóng)藥殘留。aaa[20-22]。農(nóng)藥類別 農(nóng)藥名稱 抗體類型 測定樣本 殺蟲劑 甲胺磷 多抗 蔬菜谷物 多菌靈 多抗 果汁、水 殺菌劑 百菌清 多抗、單抗水果 克菌丹 多抗 水果 100μg/㎏噻菌靈 多抗、單抗果汁、蔬菜、肉0.67mg/kg除草劑 異菌咪 多抗 類 生長調(diào)節(jié)劑 阿拉特津 多抗 啤酒、果汁 0.15-10μ

奶、果汁、玉米馬鈴薯 0.5-2μg/㎏μg/4.ELISA用于檢測存在的問題盡管優(yōu)點(diǎn)明顯，但在應(yīng)用中ELISA同樣存在缺點(diǎn)和問題。ELISA檢測系統(tǒng)中的抗農(nóng)藥抗體對于結(jié)構(gòu)非相關(guān)的靶抗原(農(nóng)藥)表現(xiàn)極高的特異性，但某些與檢交叉反應(yīng)。如果樣品中存在這些物質(zhì)，將導(dǎo)致定量檢測準(zhǔn)確度降低，農(nóng)藥在內(nèi)的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的類似物及代謝產(chǎn)物進(jìn)行多種農(nóng)藥殘留的總量檢果影響機(jī)制尚不明確，影響其特異性和穩(wěn)定性的因素還不是很清楚，從而使得ELISA在食品農(nóng)藥殘留檢測中的不確定因素增多且不易控制，難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。5.ELISA用于檢測的前景展望上文提到在ELISA監(jiān)測系統(tǒng)中，特異性抗原可能會對具有抗原相關(guān)結(jié)構(gòu)的大批量且農(nóng)藥污染又沒有規(guī)律的樣品，可以節(jié)省大量的時(shí)間和工作量。要解決好上述問題，在以后要努力做到：(1)在設(shè)計(jì)合成農(nóng)藥半抗原的過程提高農(nóng)藥半抗原篩選效率和命中率；(2)應(yīng)對ELISA對食品農(nóng)藥殘留的結(jié)果和理化分析結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性試驗(yàn)評價(jià)，同時(shí)將ELISA對食品農(nóng)藥殘留快速定性篩選與色譜、質(zhì)譜準(zhǔn)確定量檢測結(jié)合使用更為方便?？傊壳癊LISA應(yīng)用于食品農(nóng)藥殘留免疫檢測尚存在一定局限性，也不可能替代傳統(tǒng)的色譜分析技術(shù)。但ELISA分析技術(shù)自身優(yōu)勢和在方法上的不斷速檢測手段。文獻(xiàn)[1]蔡道基．農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)研究[M]．北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社．1999．[2]YukYW．Analysisforatrazineinfoaifieldcornmealandcornsusingacommercialyavailableenzymeimmunoassaymicrotiterplate[J]．BullEvitam199174(2)239allalysis[J]．CritRevFoodSciNutr，1992，32：197—229．[5]JohnH，Skerritt．Enzyme—linkedimmunosorbentassayforquantationoforganophosphatepesticides：fenitrothion，chlorpyrifos—myth—ylandpirimiphos—-metylinwheatcrainandflour—-milingfractions[J]．JofAOACInternational1992，75(3)219—228[6]KrotxkyAJ，ZeehB．Immunoassaysforresidueanalysisofagrochemicalsproposedguidelinesforprecision，standardizationandqualitycontrol[J]．PureandApplChem，1995，67：2064—2088．1989，26303—317[9]李俊鎖,錢傳范.農(nóng)藥殘留的免疫分析及其進(jìn)展[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,1999,(增37-43.1518[11]TampsPT．Recentadvancesinmultipleantigenpeptides[J]．JImmunolMeth．199619614—32[12]周思祥，劉福成．農(nóng)藥人工抗原的合成進(jìn)展．農(nóng)藥，200544(8)：337341[13]MafiapilarM．Developmentofallenzyme—linkedimmunoserbentassayforcarbaryl[J]．JAcFoodChem，1993，41：423—430．[14]NewsomeWH，ShieldsJBA．Radioimmunoassayforbenomylandmethyl2一benzimidazolecarbamateonfoodcrops[J]．JASdcFoodChem，1981，29：220222境科學(xué)與技術(shù)，2006，29(4)：100—102[16]A.Moghaddam,I.Lobersli,K.Gebhardt,M.Braunagel,O.J.Marvik,J.ImmunolMethods254(2001)169[17]J.Jodlbauer,N.M.Maier,W.Linder,J.Chromatogr.,A945(2002)45. Navarro-Villoslada,J.L.Urraca,M.C. Orellana,Sens.Actuators,B121(2007)67[19]StercenJL，R0bertJA