布魯氏菌病實驗研究及生物安全課件

布魯氏菌病實驗研究及生物安全

ResearchProgressofBrucellosisinChinaandControlandPrevention

中國人間布魯氏菌病疫情

1950-2014年

中國人間布魯氏菌病空間分布變化

省份2012年2013年

12/13增長速度（%）2014年

13/14增長速度（%）省份2012年2013年12/13增長速度（%）2014年

13/14增長速度（%）

內(nèi)蒙古124369310-25.141053813.19

云南省2757111.11133133.33

黑龍江省72357169-0.915721-20.22

安徽省2222076245.45

山西省6001708218.01873223.3

湖南省2120-4.7650150

河北省4097537531.19675625.69

福建省1546206.675417.39

新疆2185393079.86749390.66

青海省15118392.3157-51.69

吉林省1931216011.861921-11.06

江蘇省1342223.0890114.29

河南省1902330873.92525058.71

貴州省102414062158.33

遼寧省1468212944.93284133.44

江西省91122.2231181.82

山東省649127997.072845122.44

湖北省945400197337.78

陜西省61584837.89149576.3

上海市42-5020

寧夏423903113.482083130.68

四川省38166.6725225

甘肅省129499286.821404181.36

海南省2209350

天津市10617060.3818710

廣西121200020-4.76

浙江省88924.551008.7

重慶市143009125

北京市638941.2714461.8

西藏-

2-

-

-

廣東省5911086.4419072.73全國395394487713.55851530.392012/2013/2014年布病病例報告分析Amsterdam,TheNetherlands世界衛(wèi)生組織建議的人布魯氏菌病診斷世衛(wèi)組織建議的檢測包括：虎紅平板試驗(RBT)血清凝集試驗(SAT)Coomb`s試驗補體結(jié)合試驗(CFT)ELISA熒光偏振布氏菌培養(yǎng)PCR世衛(wèi)組織未具體確定流程、取舍值和檢測特征（診斷靈敏性和特異性）沒有明確的陽性和陰性預(yù)測值（PPV&NPV）結(jié)論取舍值（及靈敏性/特異性）因抗原來源和流程差異而不同，有待優(yōu)化PPV和NPV取決于疾病的流行程度，有待確立建議開展檢測前，應(yīng)在設(shè)計適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中確定診斷功效（靈敏性、特異性、PPV和NPV等）Amsterdam,TheNetherlands虎紅平板試驗檢測特征（流行率低）靈敏度92.9（急性病例）特異性94.3%（無暴露史）

特異性91.7%（重復(fù)暴露）

特異性76.9（既往布病患者）

Ruis-MezaetalClinMicrobiolInfect.2005;11(3):221-5不同來源（品牌）和批次的抗原質(zhì)量差異很大難以解讀（弱陽性）由于暴露和非特異性反應(yīng)，在疾病流行地區(qū)的表現(xiàn)不良需要確定取舍值結(jié)論診斷功效在很大程度上取決于制劑來源和疾病流行程度，需要確定取舍值血清凝集檢測發(fā)病后不同月份的靈敏度(%)0-22-44-6>6SAT(1:160)79.564.476.950.62-ME67.119.113.56.01:401:801:1601:3201:6401:1280發(fā)現(xiàn)凝集抗體（IgM和IgG)靈敏性隨疾病持續(xù)時間下降頑固性和布病復(fù)發(fā)患者中表現(xiàn)不佳在本地流行地區(qū)/暴露個體中的特異性較低流行地區(qū)的建議取舍值為1：320，提高特異性導(dǎo)致的低靈敏度難以讀取和標(biāo)準(zhǔn)化2-ME檢測可用于確診急性病(IgM的指示性滴度降低2倍或2倍以上）布氏菌可被堿性染料著色，如革蘭染色為陰性，姬姆莎染色呈紅色，布氏菌對染料吸收緩慢布氏菌革蘭染色自動培養(yǎng)儀和培養(yǎng)瓶布氏菌生化鑒定血平皿布氏菌菌落布氏菌產(chǎn)生S2H試驗BCSP31-PCR引物和擴增片段，產(chǎn)物223bpPrimer1：B45’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’Primer2：B55’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’檢測BCSP31基因的PCR方法，可以在屬的水平上檢測和鑒定布魯氏菌菌株OIE推薦鑒定布魯氏菌種的方法之一

MDL2000DNALadder

1。B.melitensis2.B.abortus3.B.suis4.B.ovis5.B.neotomae6.B.canis

M123456布魯氏菌屬BCSP31-PCR電泳結(jié)果

-----223bp

19株標(biāo)準(zhǔn)菌株AMOS-PCR擴增結(jié)果

1000bp

123456789101112131415161718

192021222000bp750bp500bp250bp200bp

1、22.DL2000DNALadder2-4.B.Melitensis1-35-11.B.Abortus1-712.B.Abortus913-17.B.Suis.1-518.B.ovis19.B.neotomae20.B.canis21.陰性對照750bp500bp250bp

M1234567891011250bp

223bp

布魯氏菌屬種鑒定1-5AMOS擴增1、c-2、羊13、牛14、豬15、待檢菌株

6-10BCSP31-PCR：6、羊17、牛1

8、豬1

9、OVIS10、待檢菌株多重PCR(Bruceladder)EvaluationofaMultiplexPCRAssay(Bruce-ladder)forMolecularTypingofAllBrucellaSpecies,IncludingtheVaccineStrains中國分離株的基因型分布省份主ST型菌株數(shù)主ST型菌數(shù)主ST型比例內(nèi)蒙古8722636.1%四川811654.5%新疆811545.5%寧夏810660.0%廣西217228.6%河南87342.9%山東87571.4%遼寧325240.0%青海85480.0%上海85240.0%安徽40.0%甘肅294250.0%廣東84250.0%吉林84375.0%生物安全布氏菌在病原微生物的危害等級劃分；

2類屬于高致病性實驗室適用等級分類：BSL-3其中弱毒株或疫苗株可在BSL-2實驗室操作小量標(biāo)本，初代分離等可以在BSL-2實驗室操作血清學(xué)檢測可以在BSL-1實驗室操作注：a大量活菌操作：實驗操作涉及“大量”病原菌的制備，或易產(chǎn)生氣溶膠的實驗操作（如病原菌離心、凍干等）。c樣本檢測：包括樣本的病原菌分離純化、藥物敏感性實驗、生化鑒定、免疫學(xué)實驗、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測活動。d非感染性材料的實驗：如不含致病性活菌材料的分子生物學(xué)、免疫學(xué)等實驗。生物安全病原微生物實驗室感染分析實驗室獲得性感染（laboratory-acquiredinfection）由于沒有監(jiān)測、報告系統(tǒng)，數(shù)據(jù)資料不全生物安全包括：實驗室實踐、實驗室設(shè)計、個人防護措施和安全設(shè)備生物安全美國一份文件統(tǒng)計實驗室感染43%由細(xì)菌，27%由病毒，15%由立克次體布氏菌是最常見的實驗室獲得性感染最多的操作是：動物攻毒試驗，凍干菌種，強毒株的大量抗原制備等生物安全感染途徑吸入、皮膚粘膜污染、攝入等吸入感染很多操作可產(chǎn)生氣溶膠，如：感染動物的皮毛、糞便，燒接種環(huán)、抽真空、離心、攪拌、研磨等氣溶膠≤5um液滴核會懸浮于空中，皮膚粘膜污染：含病原體的液體濺在眼睛、口鼻粘膜及其他皮膚感染攝入感染：誤食和不洗手吃食物接種感染

當(dāng)實驗室活動涉及傳染或潛在傳染性生物因子時，應(yīng)進(jìn)行危害程度評估。危害程度評估應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：生物因子的種類（已知的、未知的或未知傳染性的生物材料）、來源、傳染性、致病性、傳播途徑、在環(huán)境中的穩(wěn)定性、感染劑量、濃度、動物實驗數(shù)據(jù)、預(yù)防和治療。危害程度評估應(yīng)由適當(dāng)?shù)挠薪?jīng)驗的專業(yè)人員進(jìn)行。生物安全的評估生物安全設(shè)備生物安全柜吸附墊：在操作臺上放上貼有吸附材料的塑料薄膜，每日更換，可以把操作臺的污染減少到最低程度。柜內(nèi)實驗器材和材料的取出

：生物安全實驗室的廢棄的污染性材料、使用過的包裝材料、容器、紙張等廢棄物，都收裝好或者經(jīng)高壓滅菌器滅菌后拿到緩沖區(qū)：實驗中或完畢后，必須從安全柜中取出非滅活的病原體時，應(yīng)裝好放在消毒液槽中，使容器外側(cè)被消毒后取出，消毒液種類因病原體不同而異。

生物安全設(shè)備回收容器

：在安全柜內(nèi)配置回收污染物質(zhì)的容器：配置存放污染的玻璃器皿和廢棄物容器。容器中必須配有消毒液，將污染物質(zhì)完全浸沒。這些回收容器至少每天操作完畢后蓋好以防污染。再次使用時需重新清配置消毒液。瓶蓋：安全柜內(nèi)使用的瓶子不用橡膠塞，而用螺旋蓋，開啟時可減少氣溶膠的發(fā)生。消毒火焰：用火焰消毒是經(jīng)典的微生物學(xué)操作方法，但是由于會產(chǎn)生氣溶膠，并顧慮使柜內(nèi)氣流紊亂，盡量不使用。良好的內(nèi)務(wù)行為應(yīng)指定專人監(jiān)督保持良好內(nèi)務(wù)的行為。工作區(qū)應(yīng)時刻保持整潔有序。禁止在工作場所存放可能導(dǎo)致阻礙和絆倒危險的大量物品。

所有用于處理污染性材料的設(shè)備和工作表面在每班工作結(jié)束、有任何漏出或發(fā)生了其他污染時應(yīng)使用適當(dāng)?shù)脑噭┣鍧嵑拖?。對漏出的樣本或培養(yǎng)物應(yīng)在風(fēng)險評估后清除并對涉及區(qū)域去污染。清除時應(yīng)使用有效的安全預(yù)防措施、安全方法和個人防護裝備。

良好的內(nèi)務(wù)行為內(nèi)務(wù)行為改變時應(yīng)報告實驗室負(fù)責(zé)人以確保避免發(fā)生無意識的風(fēng)險或危險。實驗室行為、工作習(xí)慣或材料改變可能對內(nèi)務(wù)和/