轉基因動物與克隆(精)復習過程

轉基因動物與克隆(精)第九章掌握內容1、轉基因動物和克隆動物的概念。2、基因轉移的5種方法。3、動物克隆技術的基本方法。

第一節(jié)轉基因動物一、轉基因動物的概念將特定的外源基因導入動物受精卵或胚胎，使之穩(wěn)定整合于動物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動物。二、基因轉移的5種方法：1、顯微注射法2、反轉錄病毒感染法3、胚胎干細胞法4、電脈沖法5、精子載體導入法顯微注射法：

1、采集受精卵2、向受精卵雄性原核注入DNA溶液3、將2細胞的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的輸卵管中4、導入基因的鑒定超排卵母鼠公鼠

結扎輸精管的公鼠母鼠(一）顯微注射產生轉基因小鼠

××受精卵外源基因已注入受精卵雄性原核向假孕母鼠人工植入受精卵

可能帶有外源基因片段的小鼠假孕母鼠懷孕母鼠體視顯微鏡倒置顯微鏡顯微操作系統(tǒng)顯微操作圖示：1.用透明質酸酶沖洗輸卵管壺腹部，使受精卵與輸卵管分離，取卵，移入培養(yǎng)皿，在CO2孵箱中培養(yǎng)。2.進行顯微操作。使用由三維移動臂控制的持卵針能穩(wěn)定吸住卵母細胞，顯微注射吸管能準確地調整到與持卵針同一平面并成一直線的位置上，此時可對卵母細胞進針。（持卵針）（穿刺針）||（持卵針）（穿刺針）（二）反轉錄病毒感染法將外源基因DNA插入逆轉錄病毒載體；通過輔助細胞包裝成病毒顆粒，感染胚胎；再將感染的桑椹期胚胎導入子宮。（三）胚胎干細胞法

（1）獲取胚胎干細胞（ES細胞）；（2）將外源基因導入ES細胞；（3）獲取囊胚期胚胎；（4）將含有外源基因的ES細胞注入囊胚期胚胎的腔內；（5）將其移植到假孕動物子宮。（四）電脈沖法利用外界高電壓短脈沖使細胞膜產生可逆性穿孔，外源性DNA通過此孔可進入細胞。（五）精子載體導入法以精子作為外源性DNA的載體，通過受精作用將外源性DNA導入受精卵。三、轉基因動物的研究概況1、1960年代，將外源基因導入雞的卵巢和睪丸，得到性狀改變的雞，估計是轉基因雞。2、1974年，美國珍尼斯首次用顯微注射法獲得體細胞有SV40病毒DNA的小鼠。3、1980年，戈登完善了顯微注射技術。4、1982年，帕爾米特將大鼠生長激素基因結構區(qū)融合在SM（金屬巰蛋白基因（MT）啟動子）中，注射到小鼠受精卵雄性原核內，獲得體型似大鼠的轉基因小鼠。5、1985年，英國拉爾夫布林斯特研制出能生成人類生長激素的轉基因豬。6、1989年，意大利拉維特拉納運用精子載體法轉移外源性DNA，獲得PSV2—CAT轉基因小鼠。7、我國1980年代開始轉基因動物研究，成功研制出轉基因牛、小鼠、豬、羊、兔、金魚。新進展：2000年10月，世界首只轉基因猴在美國誕生，取名“安迪”，這是世界上首次培育成功轉基因靈長類動物。

為了能夠更有效地研究蝴蝶翅膀的顏色之迷，美國巴法羅大學(UniversityatBuffalo)的生物學家們近日成功地制造出世界上第一只轉基因蝴蝶。有意思的是，這只蝴蝶的一些基因是來自水母的。（2004年3月12日）

全身散發(fā)熒光的轉基因魚四、轉基因動物的應用：（一）生命現象的基礎理論研究：1、發(fā)育生物學研究：通過了解基因的表達、關閉和調控，了解調控順序。2、遺傳學研究觀察導入的突變基因的表達，了解基因結構與功能的關系，還可用于基因組印跡分析、遺傳缺陷的矯正等.（二）醫(yī)學研究：1、心血管疾病研究：將轉脂蛋白和轉纖維蛋白溶酶原等作為外源DNA轉入動物體內，建立心血管疾病轉基因動物模型。2、腫瘤學研究：腫瘤基因——腫瘤轉基因動物模型。3、遺傳病研究：導入遺傳疾病外源基因，制作遺傳疾病轉基因動物模型；導入正?；?，彌補基因缺陷所致遺傳疾病。4、免疫學研究：用轉基因HBsAG小鼠模型研究免疫耐受性的問題。（三）改良和培育動物新品種：使用重組DNA的轉基因技術，培育出生長快、產肉、產毛、產奶更多而耗料極少的轉基因家畜。（四）研制和生產生物活性物質：將具有醫(yī)學價值的生物活性物質（如組織型纖溶蛋白元激活因子，tPA）導入家畜或家禽的受精卵，從轉基因動物的體液如乳汁、血液、尿液、腹水中收獲基因產物。五、轉基因疾病動物模型與基因治療

動物模型（一）轉基因疾病動物模型：1、病毒性疾病模型：（1）小兒麻痹病毒受體轉基因小鼠（2）乙型肝炎病毒攜帶者模型（3）乙型肝炎表面抗原轉基因動物模型2、腫瘤轉基因動物模型

3、代謝疾病轉基因動物模型（1）高歇氏病轉基因動物模型（2）家族性神經多發(fā)性淀粉樣變（FAP）轉基因小鼠（二）基因治療的動物模型：將外源生長激素基因導入“侏儒癥”小鼠——個頭增大3倍，恢復生育能力。

左側為轉移了大鼠生長激素基因的小鼠

1982年，RichardPalmiter和RalphBrinster領導的一個小組將一個能夠被鋅調控的DNA元件與大鼠的生長激素基因連在一起，并將其注射到了受精了的小鼠胚胎中，從而培育出了世界上第一批轉基因小鼠。這些轉基因小鼠長期取食含有足量鋅的食物后，就會長得非常大。轉基因小鼠的出現掀起了遺傳學研究的新的浪潮。1987年，MartinEvans，OliverSmithies和MarioCapecch領導的幾個研究小組對胚胎干細胞中特定目標基因進行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。這三位科學家因為這項工作在2001獲得了Lasker獎。接下來，科學家們用同樣的技術又培育出了幾千只基因敲除小鼠。第二節(jié)克隆動物一、克隆動物的概念——

動物通過體細胞進行的無性生殖（也稱無性繁殖）以及由無性生殖形成的基因型幾乎完全相同的后代個體組成的群體。

世界衛(wèi)生組織在關于克隆的非正式聲明中定義為：

遺傳上同一的機體或細胞系（株）的無性生殖。

二、動物克隆技術的基本方法

（一）胚胎分割

（二）細胞核移植：1.胚胎細胞核移植2.胚胎干細胞核移植3.胎兒成纖維細胞核移植4.體細胞核移植（一）胚胎分割：將胚胎分割成2份、4份。（二）細胞核移植（孤雌繁殖）將一個細胞的細胞核移植到另一個去掉細胞核的卵或細胞中，再移植到雌性動物的子宮中孕育成熟。卵母細胞去核卵母細胞胚胎干細胞或其他細胞的細胞核

細胞核移植技術核移植1、胚胎細胞核移植:將單個早期胚胎細胞導入去除細胞核的未受精的成熟卵母細胞，經電融合，使卵母細胞質與導入的胚胎細胞核融合、分裂、發(fā)育成胚胎，將胚胎移植給受體繼續(xù)孕娠。2、胚胎干細胞核移植：胚胎或胎兒原始生殖細胞經過抑制分化培養(yǎng)，讓細胞數目增加，但不分化。將單個胚胎干細胞按照（二）1、的方法進行核移植。3、胎兒成纖維細胞核移植：從孕娠早期的胎兒體內分離出胎兒成纖維細胞，按照（二）1、的方法進行核移植。

4、體細胞核移植：將動物體細胞經過抑制培養(yǎng)，使細胞處于休眠狀態(tài)，進行核移植。綿羊“多利”就是利用體細胞核移植技術培育成功的世界第一只克隆哺乳類動物。1、從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細胞逐漸停止了分裂，此細胞稱之為供體細胞；2、從一頭蘇格蘭黑面母綿羊的卵巢中取出未受精的卵細胞，并立即將其細胞核除去，留下一個無核的卵細胞，此細胞稱之為受體細胞；3、利用電脈沖的方法，使供體細胞和受體細胞發(fā)生融合，最后形成了融合細胞，由于電脈沖還可以產生類似于自然受精過程中的一系列反應，使融合細胞也能象受精卵一樣進行細胞分裂、分化，從而形成胚胎細胞；4、將胚胎細胞轉移到另一只蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內，胚胎細胞進一步分化和發(fā)育，最后形成一只小綿羊。多莉羊的克隆2003年2月14日，英國蘇格蘭愛丁堡羅斯林研究所的科學家宣布，全世界第一個克隆動物多利羊已經死亡，活了6年半。當科學家們發(fā)現它患上無法治愈的肺病后，決定實施“安樂死”讓它長眠。一般說來，一只綿羊平均可以活１１－１２年，而多莉今年只有６歲，壽命僅相當于普通羊的一半。三、克隆動物的研究概況：（1）1952年，用豹蛙囊胚期細胞核進行了核移植，獲得可以攝食的幼體。（2）1962年，將非洲爪蟾的小腸上皮細胞的核注入同種或異種非洲爪蟾去核的未受精卵中，約1%發(fā)育為成熟蛙。（3）1986年，用胚胎分裂球與去核未受精卵融合，并用仙臺病毒或電激誘導，用核移植技術培育出克隆綿羊。（4）1994—1996年，維爾穆特培育出克隆綿羊“多利”。（5）我國的克隆動物研究：先后培育出克隆山羊、兔、牛、小鼠，曹誼林博士在裸小鼠身上克隆出人耳?？寺∨？寺∈罂寺∩窖蚩寺∝?/p>

我國首批本土自主克隆牛，這5頭出生在山東的克隆牛于2003年8月通過人工授精成功受孕，預產期為2004年4月中旬。這是我國自主完成的體細胞“克隆?！?，首次通過無性方式懷孕。我國首例異種克隆羊2004年1月21日零時在新疆誕生。異種克隆羊不同于世界上第一只克隆羊“多莉”的同種體細胞核移植的克隆方法，而是把A種動物體細胞的細胞核移植到B種動物的去核卵細胞中，生出A種動物。圖為1月30日，異種克隆北山羊（右）與接受胚胎的母山羊在一起（左）胚胎細胞克隆兔在廣西大學出生

過程：先從一只兔子身上獲得早期胚胎，注入已去除細胞核的成熟卵母細胞中，融合形成重組胚。重組胚在體外培養(yǎng)后，移入一只雌性兔子的輸卵管內，經過34天的正常孕期后，克隆兔（后）順利降生。意大利科學家2004年6月成功培育出世界上首匹“自體克隆馬”（前）。這匹名叫“普羅米塔”的小母馬（前）的“媽媽”（后）同時也是其“姐姐”。在2000年美國的《科學》雜志上，科學家宣布，他們使用新的方法成功地克隆了一只恒河猴，該獼猴被命名為“泰特拉”（Tetra），Tetra是希臘詞，意義為“四”，看來，科學家以此來暗示他們“一分為四”的方法。這是與人類血緣最近的動物———靈長目動物第一次被成功克隆?？茖W家希望，使用這種方法能生成基因完全相同的動物，供在研究諸如糖尿病和帕金森病等人類疾病時使用。四、動物克隆技術的意義與應用：（1）生物醫(yī)藥方面：對能夠生產抗凝血酶、血清白蛋白等的轉基因動物進行克隆，大批生產該藥。（2）醫(yī)學方面：利用克隆技術培育模型動物（高血壓等），直接克隆出人的心、肝、腎等器官，供器官移植。美國密蘇里大學通過克隆技術培育出四只含有熒光水母基因的小豬。五只小豬中有四只小豬的豬嘴和豬蹄呈熒光黃色（左），剩下的一只小豬（右）和正常小豬無異。專家們稱，熒光小豬的成功培育對培育動物器官用于人體移植具有重要意義。（3）畜牧業(yè)方面：選育良種后進行克隆，加快培育良種的速度。（4）保存物種：保存或克隆大熊貓等珍稀瀕危動物。附：該不該克隆大熊貓

權威專家不支持克隆大熊貓具體理由有3個：一、克隆大熊貓本身還有缺陷或者說不很完善、成熟。特別是在異種動物的克隆技術上的困難更多，比如在其他家畜上的研究表明，一般情況下異種動物克隆的胚胎發(fā)育到囊胚階段后就會停止發(fā)育，這個問題到現在無法解決。二、就現在成功的克隆動物研究例子來說，其成功率也極低，異種動物的克隆目前尚未有個體成活的報道。三、即使克隆技術完善了，異種動物的克隆技術成功了，類似大熊貓這樣的瀕危物種也不可能靠其得到拯救。因為克隆動物只是個體的復制，它根本無利物種本身的遺傳多樣性保護。與其把有限的資金花到這種前景不明的項目，不如集中精力搞好大熊貓就地和異地保護。目前鼓動大熊貓克隆之說，無異于舍本求末。美國科學家2003年5月宣布培育出一頭克隆騾子（左）。這頭小公騾被取名為“愛達荷寶石”。它頭上戴有3個“世界第一”桂冠：第一個克隆的騾子，第一個克隆的馬科動物，第一個克隆的雜種動物。科學家們說，該成果將有助于克隆其他自身繁殖有困難的瀕危動物，對研究癌癥等疾病也有重要的參考價值。

騾子體內包含63個染色體，是有62個染色體的公驢和有64個染色體的母馬