武漢大學(xué)第五版儀器分析分子發(fā)光課件

第八章分子發(fā)光分析法Molecularluminescenceanalysis2023/2/68.1概論8.1.1分子發(fā)光的類型1.分子發(fā)光—分子吸收外來能量時,分子的外層電子可能被激發(fā)而躍遷到更高的電子能級,這種處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的,它將經(jīng)多種衰變途徑而躍遷回基態(tài).包括輻射躍遷和非輻射躍遷,在輻射躍遷中伴隨發(fā)光現(xiàn)象,稱為分子發(fā)光.2023/2/62.按激發(fā)的模式分類:光致發(fā)光—分子通過吸收光能而被激發(fā)發(fā)光.化學(xué)發(fā)光(生物發(fā)光)—由化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)能或由生物體釋放出來的能量所激發(fā)而發(fā)光.3.按分子的激發(fā)態(tài)類型分類:熒光和磷光2023/2/68.1.2分子發(fā)光分析法的特點（1）靈敏度高比吸收光度法高2～4個數(shù)量級,檢測下限：0.1～0.1g/cm-3（2）選擇性強既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點：應(yīng)用范圍小。2023/2/68.2分子熒光與磷光光譜分析法8.2.1基本原理8.2.1.1熒光、磷光產(chǎn)生機理1.熒光、磷光的產(chǎn)生

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；2023/2/6平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài).電子激發(fā)態(tài)的多重度

M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)2023/2/6在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：有多種途徑和方式；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；2023/2/6傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；2023/2/6S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/2/6非輻射能量傳遞過程:

1.振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12

s。2.內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。2023/2/63.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。4.系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。

2023/2/6輻射能量傳遞過程:

1.熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為‘2的熒光；10-7～10-9

s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；‘2>2>1；S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/2/62.

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持續(xù)一段時間。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/2/62.熒光、磷光的壽命和量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率（）可見，熒光量子產(chǎn)率的大小取決于熒光發(fā)射過程與非輻射躍遷過程的競爭結(jié)果。2023/2/68.2.1.2熒光\磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件:（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。2023/2/61.共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移化合物λ/nm苯0.07283萘0.29321蒽0.46400一般而言，π電子共軛體系越大，熒光效率越高，且熒光光譜紅移。強熒光無熒光2023/2/62.剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。2023/2/63.取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強2023/2/64.躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生與躍遷相比，躍遷的大100~1000倍，壽命較短，通過系間竄躍至三重態(tài)的速率也較小，因此躍遷的熒光效率較高。激發(fā)發(fā)射2023/2/61.溶劑的影響

溶劑的極性:對許多共軛芳族化合物,激發(fā)時發(fā)生了→

*躍遷,其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性,隨著溶劑極性的增大,激發(fā)態(tài)比基態(tài)能量下降的更多---熒光光譜向長波移動氫鍵—溶劑形成氫鍵的能力增大,熒光光譜向短波移動8.2.1.3影響分子發(fā)光的環(huán)境因素2023/2/62.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；3.溫度和黏度的影響

溫度上升,將使激發(fā)態(tài)分子的振動馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化作用加劇,同時增大了發(fā)光分子與溶劑分子碰撞失活的機會,將導(dǎo)致溶液的熒光和磷光強度下降.介質(zhì)黏度的提高,將減小激發(fā)態(tài)分子振動和轉(zhuǎn)動的速率,同時由于減小了運動速率而降低了與其他溶質(zhì)分子的碰撞概率,有利于提高熒光或磷光的強度2023/2/64.有序介質(zhì)的影響表面活性劑或環(huán)糊精溶液—對發(fā)光物質(zhì)具有增溶、增敏、增穩(wěn)的作用,是提高發(fā)光分析法靈敏度和選擇性的有效途徑.8.2.1.4溶液熒光的猝滅發(fā)光分子與溶劑或溶質(zhì)之間發(fā)生的導(dǎo)致發(fā)光強度下降的物理或化學(xué)作用過程.

淬滅劑動態(tài)淬滅—淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子互相碰撞,以能量轉(zhuǎn)移或電荷轉(zhuǎn)移使發(fā)光分子失去激發(fā)能而不能返回基態(tài)靜態(tài)淬滅--淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),所產(chǎn)生的絡(luò)合物在實際檢測區(qū)內(nèi)不發(fā)光.2023/2/68.2.1.5激發(fā)光譜與發(fā)射(熒光或磷光)光譜

excitationspectrumandfluore-scencespectrum

1.激發(fā)光譜曲線

固定熒光(磷光)的發(fā)射波長(即測定波長),不斷改變?nèi)肷涔獠ㄩL,得到熒光(磷光)強度與入射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大；2023/2/62.熒光光譜(或磷光光譜)—發(fā)射光譜曲線固定激發(fā)光波長(入射光波長),不斷改變熒光(磷光)的測定波長(發(fā)射波長),得到熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。2023/2/63.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，由于振動弛豫消耗了能量。2023/2/6b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2

,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如‘2

)。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2023/2/6維生素B2熒光發(fā)射光譜發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)2023/2/6c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。2023/2/6鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

2023/2/68.2.1.6熒光(磷光)強度與溶液濃度的關(guān)系1.熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率f：

If

=f

Ia

由朗-比耳定律：If

=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)

濃度很低時，近似處理后：

If=2.3φfI0εbc=Kc其中：φf為熒光效率，I0為激發(fā)光的強度，ε熒光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程，c為熒光物質(zhì)的濃度。熒光強度和溶液濃度呈線性關(guān)系，只限于極稀的溶液。對于較濃溶液，會產(chǎn)生濃度猝滅現(xiàn)象。2023/2/62.磷光強度與磷光物質(zhì)濃度的關(guān)系

當(dāng)磷光物質(zhì)濃度很小時，磷光強度Ip與磷光物質(zhì)濃度c之間的關(guān)系式為:

Ip=2.3φpI0εbc

式中：φp為磷光效率，I0為激發(fā)光的強度，ε磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程。

在一定條件下，φp、I0、ε、b均為常數(shù)，所以上式可寫成：

Ip=Kc

即磷光強度與磷光物質(zhì)的濃度c成正比。2023/2/63.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；2023/2/6200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜2023/2/68.2.2熒光、磷光儀器8.2.2.1熒光分析儀器

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、單色器、檢測器

2023/2/61、光源：氙燈和高壓汞燈2、單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器3、樣品池：石英4、檢測器：光電倍增管光源第一單色器第二單色器激發(fā)熒光樣品池檢測系統(tǒng)2023/2/6熒光檢測器有兩個單色器，光源與檢測器呈90度角，以避開激發(fā)光、雜散光的干擾，增加檢測靈敏度。I0IfIt紫外－可見檢測器

分光系統(tǒng)(雙單色器)第一單色器作用：選擇激發(fā)波長第二單色器作用：分離出熒光發(fā)射波長樣品池四面透光2023/2/6儀

器

光

路

圖2023/2/6該型儀器可進(jìn)行熒光、磷光和發(fā)光分析；2023/2/6同步掃描技術(shù)同步掃描技術(shù)可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；如圖。2023/2/6可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖2023/2/62023/2/68.2.2.2磷光分析儀器與熒光分析儀器基本相似。

熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進(jìn)行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。1、試樣室將試樣放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，即可用于低溫磷光測定。2023/2/62、磷光鏡有些物質(zhì)同時會發(fā)生熒光和磷光，為了能在同時有熒光現(xiàn)象的體系中測定磷光，通常必須在激發(fā)光單色器和液槽之間以及在液槽和發(fā)射光單色器之間各裝一個斬波片，并由一個同步馬達(dá)帶動，這種裝置稱作磷光鏡。2023/2/68.2.3熒光的常規(guī)測定方法1、直接測定法2、間接測定法熒光衍生法、熒光淬滅法、敏化熒光法3、多組分混合物的熒光分析2023/2/68.2.4磷光的測定方法與熒光相比，磷光具有兩個特點：（1）磷光輻射的波長比熒光長（2）磷光的壽命比熒光長8.2.4.1低溫磷光分析隨著溫度的降低，磷光逐漸增強用液氮作冷卻劑（77K）2023/2/6重原子效應(yīng)：使用含有重原子的溶劑或在磷光物質(zhì)中引入重原子取代基，都可以提高磷光物質(zhì)的磷光強度，這種效應(yīng)稱作重原子效應(yīng)。2023/2/68.2.4.2室溫磷光由于低溫磷光需要低溫實驗裝置、溶劑選擇的限制，發(fā)展了以下幾種室溫磷光法：1、固體表面室溫磷光法

此法測量室溫下吸附于固體基質(zhì)（載體）上的有機化合物所發(fā)射的磷光。理想的載體是既能將分析物質(zhì)牢固地束縛在表面或基質(zhì)中以增加剛性，并減小三重態(tài)的碰撞猝滅等非輻射去活化過程，而本身又不產(chǎn)生磷光背景。2023/2/62、膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法

當(dāng)向溶液中加入適量的表面活性劑，形成膠束，由于膠束的多相性，改變了磷光團(tuán)的微環(huán)境和定向的約束力，從而強烈影響了磷光團(tuán)的物理性質(zhì)，減小了內(nèi)轉(zhuǎn)化和碰撞能量損失等非輻射去活化過程的趨勢，明顯增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，從而可以實現(xiàn)在溶液中測量室溫磷光。2023/2/68.2.5熒光分析法的應(yīng)用1、無機化合物的分析與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定目前熒光分析大多用于定量分析，由于自身發(fā)射熒光的化合物不多，因此往往利用有機試劑與熒光較弱或不顯熒光的物質(zhì)結(jié)合形成發(fā)熒光的配合物來進(jìn)行測定。2023/2/62023/2/62、有機化合物的分析

芳香族化合物具有共軛的不飽和結(jié)構(gòu)，多能發(fā)生熒光，可以直接進(jìn)行熒光測定；而脂肪族化合物的分子結(jié)構(gòu)較簡單，本身能發(fā)熒光的很少，須與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行分析。

2023/2/68.2.6磷光分析法的應(yīng)用1.稠環(huán)芳烴分析

采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）2023/2/62023/2/62.農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析檢測限0.01g/cm-3

3.藥物分析和臨床分析2023/2/68.3化學(xué)發(fā)光分析法

Chemiluminescenceanalysis2023/2/68.3.1概論1、化學(xué)發(fā)光

某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過程中，由于吸收了反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光，這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光。

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)?；瘜W(xué)發(fā)光分析利用某些化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光發(fā)射現(xiàn)象而建立的一種分析方法。2023/2/62、特點1.靈敏度極高

例：熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學(xué)發(fā)光分析，可測定210-17Mol/L的ATP，即可檢測出一個細(xì)菌中的ATP含量2.儀器設(shè)備簡單

不需要光源、單色器和背景校正；3.發(fā)射光強度測量無干擾

無背景光、散射光等干擾；2023/2/6線性范圍寬分析速度快缺點：可供發(fā)光用的試劑少；發(fā)光反應(yīng)效率低（大大低于生物體中的發(fā)光）；機理研究少。2023/2/68.3.2基本原理principle1.產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)必須滿足的條件

在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能快速地釋放出足夠的能量。能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)大多為有機化合物，芳香族化合物；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)，E=170～300kJ/mol；

發(fā)光位于可見光區(qū)；2023/2/6（2）反應(yīng)歷程有利于激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的形成；（3）激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)；2023/2/62.化學(xué)發(fā)光效率生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的效率激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的發(fā)光效率化學(xué)效率主要取決于發(fā)光所依賴的化學(xué)反應(yīng)本身；而發(fā)光效率則取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響。2023/2/6發(fā)光強度化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強度Icl是以單位時間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示，它與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)。時刻t的化學(xué)發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))：

在化學(xué)發(fā)光分析中，常用已知時間內(nèi)的發(fā)光總強度來進(jìn)行定量分析2023/2/68.3.3化學(xué)發(fā)光的類型8.3.3.1氣相化學(xué)發(fā)光主要有O3，NO,S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測空氣中的O3，NO,NO2，H2S,SO2和CO等.2023/2/61、O3的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h

最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng/cm-3

～1g/cm-3；2023/2/62、氮氧化合物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm靈敏度1ng/cm-3；2023/2/63.氧原子與SO2的發(fā)光反應(yīng)

O3

→O2

+O（1000C石英管中進(jìn)行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2

*→SO2*+h

最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3

2023/2/6

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h

發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng/cm-3氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：2023/2/6氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h發(fā)射光譜范圍：300～500nm靈敏度1ng/cm-32023/2/64、火焰化學(xué)發(fā)光

在富氫火焰中存在著很強的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；（1）一氧化氮

NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h

發(fā)射光譜范圍：660～770nm；

最大發(fā)射波長：690nm；

在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O該反應(yīng)十分迅速；2023/2/6