分子生物學第十章核酸分子雜交技術1課件

第十章核酸分子雜交技術

第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理

具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。

變性復性DNA-DNA雜交雙鏈分子一、DNA變性與復性

（一）DNA變性1、定義：某些理化因素導致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性3、變性后的理化性質變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加4、DNA變性曲線AT區(qū)先解鏈GC區(qū)后解鏈階梯式曲線5、GC含量與Tm值之間的關系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.32、復性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子3、復性的速率方程（服從二級反應動力學）dCdt=K2C2（1）將（1）積分CCo11+K2Cot=（2）一半單鏈DNA分子復性時，（2）式中的為121211+K2Cot=Cot1/2值越大，復性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=

二、影響雜交的因素1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復性速度越快分子越大，復性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過高影響雜交效率3、離子強度：（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交

5、核酸分子的復雜性：（1）核酸的復雜性是指存在于反應體系中不同順序的總長度（2）Cot?與反應體系中核酸復雜性成正比（3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復雜性

第二節(jié)核酸分子雜交的方法按待測核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相雜交膜上印跡雜交原位雜交液相雜交

RNA酶保護分析法核酸酶S1保護分析法

一、Southern印跡雜交（一）待測核酸樣品的制備1、裂解或破碎細胞2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段（二）待測DNA樣品的電泳分離1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應，大分子DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶3、分子量標準：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標準可用核素標記

（四）Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉移到一定的固相支持物上的過程1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應具備的特性①具有較強結合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應③與核酸分子結合穩(wěn)定牢固④具有良好的機械性能

非特異吸附少（2）常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本底低。缺點是DNA分子結合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點是結合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高③化學活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結合；對不同大小的DNA片段有同等結合能力；缺點：結合能力較上述兩種膜低（2）電轉法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上。（3）真空轉移法

此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。（七）Southern雜交在醫(yī)學中的應用1、酶切圖譜分析2、特定基因定性和定量3、基因突變分析4、限制性片段長度多態(tài)性的分析二、Northern印跡雜交1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性2、轉膜：RNA轉膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉膜前需進行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNA三、斑點及狹縫印跡雜交1、斑點印跡為圓形2、狹縫印跡為線狀3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量四、原位雜交1、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交保持組織細胞的形態(tài)對核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對雜交信號無遮蔽作用理化性質穩(wěn)定2、雜交過程：（1）組織或細胞的固定理想固定液應具備：（2）組織細胞雜交前的預處理去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白質組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質結合成核酸蛋白復合體控制消化時間，避免細胞結構破壞和核酸從載玻片上脫落（3）探針的選擇與標記以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長度一般為50~300bp,有時達1.5kb

放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定檢測結果分辨率高，但信號檢測時間長

非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察（4）雜交雜交液體積?。?0~20μl

cDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時間:DNA探針雜交為2~4h.RNA探針雜交過夜

雜交前一般將組織切片置95℃5~15分鐘使DNA變性沖洗溫度一般不超過50℃（5）雜交結果檢測所用探針為核素標記,放射自顯影檢測

所用探針為非核素標記,比色或化學發(fā)光檢測五、液相雜交指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。（一）RNA酶保護分析法1、RNA酶保護分析法原理RNaseA和RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈RNA，不水解探針RNA與待測RNA互補形成的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護，稱RNA酶保護分析法。2、雜交過程

制備待測RNARNA探針的制備與標記：體外轉錄法制備和標記RNA探針雜交：待測RNA與RNA探針在液相中雜交

RNaseA和RNaseTI除去單鏈RNA

電泳分離RNA

放射自顯性檢測雜交結果（二）核酸酶S1保護分析法1、原理核酸酶S1在一定條件下專一水解雜交體系中的單鏈DNA和單鏈RNA，不水解DNA探針與待測RNA雜交形成的雜交體，使雜交分子得到保護，稱核酸酶S1保護分析法2、雜交過程制備待測RNA：總RNA或mRNA均可單鏈DNA探針的制備與標記雜交：單鏈DNA探針與待測RNA在液相中雜交核酸酶S1除去單鏈DNA和單鏈RNA

電泳分離DNA/RNA雜交體分子放射自顯影檢測雜交結果第三節(jié)探針的標記

一、探針的種類

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針

寡核苷酸探針二、標記物（一）理想標記物應具備的特性：

高度靈敏性不影響堿基配對的特異性不影響探針分子的主要理化性質對酶促反應活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性(二)標記物種類

核素標記物：32p、35s、3H

非核素標記物半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學發(fā)光探針：標記物與某種底物反應發(fā)光，如生物素酰化的堿性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

三、標記方法

體內(nèi)標記法：將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使核素摻入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中

體外標記法：化學標記法：標記物分子上的活性基因與探針分子上的某些基因反應，標記物直接結合到探針分子上酶促標記法：標記物預先標記核苷酸，然后利用酶促法將標記的核苷酸摻入到探針上

酶促標記法（一）切口平移法（nicktranslation)1、利用DNaseI在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時將標記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中（二）隨機引物法其原理是隨機引物能與各種單鏈DNA模板結合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補。另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互補的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中隨機引物法所具有的優(yōu)點：1、能進行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標記2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當所帶來的一系列問題3、標記活性高，標記活性可達108cpm/μgDNA以上4、可直接