食品微生物檢驗第二章

食品微生物檢驗2014年3月第二章食品微生物檢驗條件及基本技術一.食品微生物檢驗條件二.微生物檢驗基本技術第一節(jié)食品微生物檢驗基本條件一、微生物檢驗室定義：指用于食品衛(wèi)生微生物檢驗的實驗室。（一）環(huán)境基本要求：實驗室環(huán)境不影響檢驗結果的準確性。要求：實驗室的工作區(qū)域與辦公區(qū)域明顯分開。食品微生物實驗室生物實驗室級別管理制度建設布局常用儀器及用途生物安全水平分級生物安全防護水平（biosafetylevel，BSL）分為4級，以表示實驗室的相應生物安全防護水平。BSL－1：防護水平最低,普通建筑物即可，每個實驗室應設洗手池。BSL-2：實驗室的門有可視窗。在實驗室工作區(qū)域外還應當有供長期使用的存儲空間。在實驗室內使用專門的工作服；應戴乳膠手套。配備高壓蒸汽滅菌器，在實驗室內配備生物安全柜。BSL-2生物安全水平分級BSL—3實驗室：自成隔離區(qū)（有出入控制）或為獨立建筑物。BSL—4防護水平最高。實驗室應建造在獨立的建筑物內或建筑物中獨立的完全隔離區(qū)域內，該建筑物應遠離城區(qū)。實驗室管理制度

1．實驗室應制定儀器配備管理使用制度，藥品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根據(jù)安全制度和環(huán)境條件的要求，本室工作人員應嚴格掌握，認真執(zhí)行。2．進入實驗室必須穿工作服，進入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非實驗室人員不得進入實驗室，嚴格執(zhí)行安全操作規(guī)程。3．實驗室內物品擺放整齊，試劑定期檢查并有明晰標簽，儀器定期檢查、保養(yǎng)、檢修,嚴禁在冰箱內存放和加工私人食品。4．各種器材應建立請領消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應填寫報告；藥品、器材、菌種不經(jīng)批準不得擅自外借和轉讓，更不得私自拿出。5．禁止在實驗室內吸煙、進餐、會客、喧嘩，實驗室內不得帶入私人物品，離開實驗室前認真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應按有關要求執(zhí)行。檢驗室建設布局圖1.辦公臺2.文件柜3.樣品柜4.通風櫥5.實驗邊臺6，7.無菌臺8.天平臺9.在落地儀器區(qū)再加個高溫儀器臺，放高壓滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、電熱板等無菌室建設檢驗環(huán)境要求

微生物學檢驗室要求操作區(qū)域與辦公區(qū)域分開。洗滌室、培養(yǎng)室、消毒間、無菌室應分開。無菌室要設有套間或緩沖間，最好設推拉門，以防空氣振蕩過大。微生物檢驗室應備有自動或腳踩式洗手池和固定的消毒設施。

（二）人員基本要求：檢驗人員應具有相應的教育、微生物專業(yè)培訓經(jīng)歷，具備相應的資源，能夠理解并正確實施檢驗。檢驗人員應掌握實驗室生物檢驗安全操作知識和消毒知識。檢驗人員應在檢驗過程中遵守相關預防措施的規(guī)定，保證自身安全。注：有顏色視覺障礙的人員不能涉及辨色的實驗。二、無菌室的建設（一）無菌技術1、對使用的器具及培養(yǎng)基的滅菌2、創(chuàng)造無菌環(huán)境食品微生物實驗室常用儀器及用途潔凈工作臺（超凈工作臺、無菌臺）是一種供人操作的通用型局部凈化設備，通過風機將空氣吸入，經(jīng)由靜壓箱通過高效過濾器過濾，將過濾后的潔凈空氣以垂直或水平氣流的狀態(tài)送出，使操作區(qū)域持續(xù)在潔凈空氣的控制下達到百級潔凈度它可造就局部高清潔度空氣環(huán)境。生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的。高壓滅菌鍋烘箱

培養(yǎng)箱水浴鍋顯微鏡普通光學顯微鏡顯微鏡被用來放大微小物體的圖像。一般應用于對生物、醫(yī)藥、微觀粒子等觀測。分光光度計分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量pH計離心機PCR儀原理：采用實時熒光PCR技術檢測食品中是否有致病菌；靈敏度：對目標菌檢測靈敏度為1個/g效率：檢測過程用時2-4H主要耗材：各菌種試劑盒真空泵冰箱純水機振蕩器/均質機移液器其它儀器二、常用玻璃儀器及用具1、移液管

1ml，2ml，5ml，10ml，25ml

（一）量器類2、容量瓶

50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml3、量筒

容量（ml）10、25、50、10、25、500、1000、2000固定體積移液器

數(shù)字型可調移液器P型

4、微量取樣器（二）、其他常用玻璃器皿3.5cm,7cm，9cm，15cm

1、培養(yǎng)皿2、試管各種試管的使用

13mmX100mm

：生化反應及凝集反應

15mmX150mm

：斜面培養(yǎng)

18mmX180mm：檢樣稀釋型號150ml，200ml，250ml，500ml，1L，2L，3L

3、三角瓶

燒杯

容量（ml）：30、50、100、150、250、400、600、1000、2000、3000三、玻璃器皿的清洗和滅菌(一)、新購的玻璃器皿1、先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈。2、再浸泡于１～２％的鹽酸中數(shù)小時，最后用流水沖凈。(二)、用過的玻璃器皿

1、含油脂器材的清洗（1）、單獨高壓滅菌；（2）、趁熱倒去污物；（3）、倒放在鋪有吸水紙的籃子上，置100℃烘箱中烤0.5h;（4）、再用5%的碳酸氫鈉水煮兩次，再用肥皂水刷洗干凈。2、含菌試管的清洗高壓滅菌后，肥皂水刷洗干凈，烘干或晾干備用。3、含菌平皿的滅菌（1）、底蓋分開放，放入桶中，高壓滅菌；（2）、趁熱倒去污物；（3）、肥皂水刷洗干凈，烘干或晾干備用。4、含菌吸管的清洗（1）、把含菌吸管投入3%的來蘇爾液內浸泡30min以上殺菌；（2）、用肥皂水洗滌一次；（3）、最后用清水沖洗干凈即可。5、載玻片及蓋玻片的清洗（1）將載玻片及蓋玻片分別浸入5%的來蘇爾液內浸泡過夜，取出水洗干凈；（2）蓋片用軟布擦干即可；（3）染色用的載玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干凈，最后用95%的酒精浸泡片刻，晾干備用。（三）、玻璃器材的滅菌（1）清洗后烘干；（2）加塞包扎；（3）滅菌:

干熱滅菌:160~165℃烘箱中烤2h

濕熱滅菌:121℃20min第二節(jié)食品微生物檢驗技術第一節(jié)細菌的大小與形態(tài)大小計量單位是微米（μm）染色革蘭染色法形態(tài)球形桿形螺形光學顯微鏡細菌的大小與形態(tài)大多數(shù)球菌直徑約為1.0μm大多數(shù)桿菌長約2-3μm，直徑0.3-0.5μm大腸埃希菌

霍亂弧菌鏈球菌

第二節(jié)細菌的結構基本結構：核質、細胞質、細胞膜、細胞壁特殊結構：鞭毛、菌毛、芽胞、莢膜細胞膜細胞壁莢膜核糖體核質菌毛鞭毛核質（nuclearmaterial）單一密閉環(huán)狀DNA分子組成球形、棒狀或啞鈴狀化學組成DNA，RNA和蛋白質細胞質/漿（cytoplasm）核糖體質粒胞質顆粒中介體核糖體（ribosome）功能：合成蛋白質的場所沉降系數(shù)為70S：50S和30S亞基鏈霉素紅霉素

概念染色體外的遺傳物質，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA，帶有遺傳信息，控制細菌某些特定的遺傳性狀。特點自我復制相互傳遞自行丟失質粒（plasmid）□貯藏營養(yǎng)物質□異染顆粒嗜堿性強鑒別細菌白喉棒狀桿菌胞質顆粒中介體（mesosome）細胞膜內陷、折疊、卷曲形成的囊狀物多見于G+細菌參與細菌分裂擬線粒體白喉棒狀桿菌中介體透射電鏡圖×130000細胞膜（cellmembrane）半透性薄膜功能物質轉運生物合成呼吸作用分泌作用細菌的結構

核

質細胞質：核糖體、質粒、胞質顆粒、中介體細胞膜

細胞壁

莢膜鞭毛菌毛芽胞

基本結構特殊結構細胞壁（cellwall)功能維持菌體外形抵抗低滲環(huán)境營養(yǎng)攝取和物質交換抗原性

結構G+菌G-菌肽聚糖（peptidoglycan）原核細胞所特有

革蘭陽性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側鏈、五肽交聯(lián)橋啊啊AA革蘭陽性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側鏈、五肽交聯(lián)橋青霉素作用點

溶菌酶作用點N-乙酰葡糖胺

N-乙酰胞壁酸革蘭陰性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側鏈革蘭陰性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側鏈G+菌與G-菌肽聚糖結構比較

革蘭陽性菌細胞壁特殊組分：磷壁酸

膜磷壁酸壁磷壁酸革蘭陽性菌細胞壁結構

脂蛋白、脂質雙層、脂多糖(內毒素)革蘭陰性菌細胞壁特殊組分-外膜脂多糖（LPS）

G-菌內毒素脂質A：內毒素的毒性和生物學活性的主要部分;無種屬特異性核心多糖：具有屬特異性特異多糖：G-菌的菌體抗原；具種特異性G+菌與G-菌細胞壁結構比較G+菌與G-菌細胞壁結構比較細胞壁 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌強度較堅韌較疏松厚度 20-80nm10-15nm肽聚糖組成聚、四、五聚、四、無肽聚糖結構類型三維立體結構二維平面結構肽聚糖層數(shù)可多達50層1-2層肽聚糖含量

50%-80%5%-20%糖類含量多少脂類含量少多磷壁酸有無外膜 無有 G+

菌與G-

菌細胞壁的比較項目革蘭陽性菌革蘭陰性菌細胞壁的關系染色性紫色紅色細胞壁對酒精的通透性抗原性主要為磷壁酸主要為外膜細胞壁的化學組成不同毒性無內毒素有內毒素為陰性菌細胞壁成分對青霉素的作用有效無效作用于肽聚糖、五肽交聯(lián)橋細胞壁缺陷型（細菌L型）細胞壁受損的細菌能夠生長和分裂者原生質體原生質球高度多形性，生長緩慢油煎蛋狀菌落某些L型引起慢性感染細胞壁缺陷型（細菌L型）的特點著色不均勻,多為革蘭陰性菌除去誘發(fā)因素,可以恢復成原菌作用于細胞壁的抗菌藥物對其感染治療無效細菌的結構

核

質細胞質：核糖體、質粒、胞質顆粒、中介體細胞膜細胞壁

莢膜鞭毛菌毛芽胞

基本結構特殊結構細菌的特殊結構－莢膜（capsule）某些細菌在其細胞壁外包繞一層粘液性物質，為多糖或多肽的多聚體，用理化方法去除后并不影響細胞的生命活動。功能抗吞噬作用粘附作用齲齒抗有害物質的損傷作用細菌的特殊結構－鞭毛（flagellum）成分為蛋白質具有抗原性鞭毛菌分成4類功能液體中能自由游動,

運動器官與致病性有關鑒定細菌和進行分類細菌的特殊結構－菌毛（pilus）許多革蘭陰性菌和少數(shù)革蘭陽性菌菌體表面存在著一種比鞭毛更細、更短而直硬的絲狀物，與細菌的運動無關。蛋白質,菌毛蛋白有抗原性分類普通菌毛:數(shù)量多，短而細粘附結構，與致病有關性菌毛:少數(shù)革蘭陰性菌,少粗、長、中空傳遞某些遺傳物質菌毛（pilus）F+F-F+F-F+F+F+F+細菌的特殊結構－芽胞（spore）概念產(chǎn)生芽胞的都是革蘭陽性菌芽胞的大小、形狀、位置等隨菌種而異細菌芽胞的形態(tài)芽胞形成芽胞

細胞分裂繁殖體周期子代細胞

強大的抵抗力

可在自然界中存在多年，是重要的傳染源。芽胞并不直接引起疾病，只有發(fā)芽成為繁殖體后,才能迅速大量繁殖而致病。有重要的鑒別意義。芽胞是否被殺死作為判斷滅菌效果的指標芽胞（spore）胞質顆粒核糖體菌毛擬核細胞壁細胞膜質粒鞭毛莢膜細菌結構總結第三節(jié)細菌形態(tài)檢查法顯微鏡放大法細菌形體微小，肉眼不能直接看到，必須借助顯微鏡（普通光學顯微鏡、電子顯微鏡）放大后才能觀察。染色法細菌體小半透明，經(jīng)染色后才能觀察較清楚。顯微鏡放大法普通光學顯微鏡——普通光學顯微鏡的分辨率為

0.25um。一般細菌都大于0.25um，故可用普通光學顯微鏡觀察。

抗酸染色電子顯微鏡——電子顯微鏡的分辨率為1nm。不僅能看清細菌的外形，內部超微結構可一覽無余。肺炎鏈球菌莢膜莢膜顯微鏡放大法（二）細菌的染色應用：主要用于檢查生活狀態(tài)下細菌的動力及運動狀況常用方法：壓滴法、懸滴法、暗視野顯微鏡檢查不染色標本檢查不染色標本檢查-壓滴法載玻片細菌懸液蓋玻片染色標本的檢查-常用染料堿性染料

電離后顯色離子帶正電荷，易與帶負電荷的被染物結合。細菌的等電點在pH2~5之間，易與帶正電荷的染料結合而著色。常用的染料有堿性復紅、結晶紫、亞甲藍等。酸性染料:電離后顯色離子帶正電荷，易與帶負電荷的被染物結合。通常用來染細胞質，而很少用于細菌的染色。常用的染料有伊紅、剛果紅等。復合染料（中性染料）及熒光染料

復合染料是堿性染料和酸性染料的復合物，如瑞氏染料（伊紅亞甲藍）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料如熒光標記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。用于某些特殊的染色技術。脂溶性染料

如Sudanblack。染色標本的檢查染色方法的種類單染法:采用一種染料染色復染法（鑒別染色）:采用兩種或兩種以上的不同染料進行先后染色，使不同種類的細菌、同種細菌的不同結構，分別染上不同的顏色，以便鑒別細菌。革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑

步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上

步驟2：用無菌操作法取少許培養(yǎng)物于蒸餾水滴上

步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層

步驟4：風干

步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定步驟6：結晶紫染色1分鐘

步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片

步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗

步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗

步驟10：番紅復染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗

大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖

革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革蘭氏染色

革蘭氏染色陽性球菌（紫色）

注意事項1．革蘭氏染色成敗的關鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴格把握脫色時間。2．選用培養(yǎng)18-24小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。3.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實驗成功的關鍵。步驟：結果:

陽性菌——紫色

陰性菌——紅色結晶紫初染碘液媒染乙醇脫色復紅復染涂片固定由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立。革蘭染色法（GramStain）特殊染色莢膜染色特殊染色

負染色（墨汁染色）特殊染色

染色法革蘭染色法在鑒別細菌、選擇抗菌藥物、研究細菌致病性等方面有意義

其他染色法單染色法、抗酸染色法、以及特殊染色法二、培養(yǎng)基的制備技術

培養(yǎng)基是指以液體、半固體或固體形式，包含天然或合成成分，用于促進微生物的繁殖或保持其活力的物質組成。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標準，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。（一）培養(yǎng)基的分類1、根據(jù)培養(yǎng)基的組成來源不同來區(qū)分:天然培養(yǎng)基;合成培養(yǎng)基;半合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料。如：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等

優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好，來源廣泛.缺點：成分難以確切知道。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是一類化學成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學成分的化學藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學成分精確、重復性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。半合成培養(yǎng)基

在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。

這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。

固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基。2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分液體培養(yǎng)基

所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。

固體培養(yǎng)基

在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。在實驗室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等。

半固體培養(yǎng)基

把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2～1%之間。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。運輸培養(yǎng)基；保存培養(yǎng)基；增菌培養(yǎng)基。3、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分運輸培養(yǎng)基

在取樣后和實驗室樣品處理前的時間，保護和維持微生物活性的培養(yǎng)基（如Stuart或Amies運輸培養(yǎng)基）。運輸培養(yǎng)基中通常不允許包含使微生物增殖的物質，但是培養(yǎng)基應能保護菌株，確保它們不變質。保存培養(yǎng)基

用于在一定期限內保護和維持微生物活力，以防對微生物在長期保存中產(chǎn)生不利影響，或使微生物在長期保存后容易復蘇的培養(yǎng)基（如Dorset卵黃培養(yǎng)基）。復蘇培養(yǎng)基

能夠使受損或應激的微生物修復，使微生物恢復正常生長能力，但不一定促進微生物繁殖的培養(yǎng)基。增菌培養(yǎng)基

大多為液體培養(yǎng)基，能夠給微生物的繁殖提供較適當?shù)纳L環(huán)境，包括：

A.選擇性增菌培養(yǎng)基：能夠保證特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他菌體生長的培養(yǎng)基（如SC、LST、RV等）；

B.非選擇性增菌培養(yǎng)基：能夠保證大多數(shù)微生物生長的培養(yǎng)基（如M肉湯、營養(yǎng)肉湯）。分離培養(yǎng)基

支持微生物生長的固體或半固體培養(yǎng)基，包括：

A.選擇性分離培養(yǎng)基：支持特定微生物的生長而抑制其他微生物生長的培養(yǎng)基（如PALCAM瓊脂、TCBS、顯色培養(yǎng)基等）；

B.非選擇性分離培養(yǎng)基：對微生物沒有選擇性抑制的分離培養(yǎng)基（如腦心浸液肉湯、營養(yǎng)瓊脂）。鑒別培養(yǎng)基

能夠進行一項或多項微生物生理學和生化特性鑒定試驗的培養(yǎng)基（如尿素培養(yǎng)基、Kligler瓊脂等）；能夠用于分離培養(yǎng)的鑒別培養(yǎng)基被稱作分離/鑒別培養(yǎng)基（如XLD、DHL、TCBS等）。鑒定培養(yǎng)基

能夠產(chǎn)生一個特定的鑒定反應而不需要做進一步確認實驗的培養(yǎng)基（如ONPG、氧化酶試劑）。用于分離的鑒定培養(yǎng)基被稱為分離/鑒定培養(yǎng)基（如顯色培養(yǎng)基）。

顯色培養(yǎng)基是在選擇性培養(yǎng)基上加入了適量的帶發(fā)色及熒光基團的酶底物，發(fā)色團（熒光團）與特殊酶可識別的基團相連。目標微生物產(chǎn)生一些特殊的可水解發(fā)色及熒光底物的酶，使得發(fā)色和熒光基團釋放出來，從而使目標微生物帶上易于辨別的特殊顏色或發(fā)出熒光。多用途培養(yǎng)基

同時具有多種不同用途的特定培養(yǎng)基。例如，血瓊脂是一種復蘇培養(yǎng)基，又是分離培養(yǎng)基，還可作為溶血實驗的鑒別培養(yǎng)基。(1)即用型培養(yǎng)基：以即用形式置于容器中（如平皿、試管或其他容器）供應的培養(yǎng)基。(2)商品化脫水合成培養(yǎng)基：不立即使用的干粉形式的（如粉末、小顆粒、凍干等形式）培養(yǎng)基。溶于水后能制備成一種或兩種類型的培養(yǎng)基：

a)完全即用型培養(yǎng)基：不需要添加其他成分的培養(yǎng)基；

b)不完全即用型培養(yǎng)基：使用時加入不穩(wěn)定成分。4、

根據(jù)培養(yǎng)基的制備方法不同來區(qū)分5、

實驗室制備個別成分培養(yǎng)基

實驗室按照培養(yǎng)基配方逐一稱取個別成分，按照培養(yǎng)基制備程序進行。二、培養(yǎng)基的制備正確制備培養(yǎng)基是微生物檢驗的一個基本步驟。在處理脫水培養(yǎng)基和其他含有有害物質（如膽鹽或其他選擇劑）的培養(yǎng)基時，應遵守良好實驗室規(guī)范（GLP）和生產(chǎn)廠商的注意事項。使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時，應嚴格按照廠商提供的使用說明配制，如質量（體積）、pH、制備條件、滅菌條件、操作步驟等。當使用獨立成分制備培養(yǎng)基時，按配方準確配制并記錄所有配制步驟。另外，記錄所有使用成分的特性（如代號和批號等）。（1）水

配制培養(yǎng)基應使用蒸餾水或相同質量的水，目的是排除抑制或影響微生物生長的物質。為保證蒸餾水的質量，蒸餾水的電阻率最少應達到0.3MΩ/cm。建議不使用未經(jīng)過微生物含量檢測的水（細菌總數(shù)應小于1000CFU/mL）。（2）稱量和復水

稱量所需的脫水培養(yǎng)基（注意緩慢操作，必要時佩戴口罩或在通風櫥中操作，以防吸入含有有毒物質的培養(yǎng)基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培養(yǎng)基結塊），然后再加水至所需的量。（3）溶解和分裝

脫水培養(yǎng)基加水后適當加熱，并不停攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱前應先浸泡幾分鐘。由個別成分制備的培養(yǎng)基應將不同成分分別加入適量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。（4）pH的測定和調整用pH計測pH，必要時進行調整。在實驗室用個別成分制備的培養(yǎng)基，除特殊說明外，培養(yǎng)基滅菌并冷卻到25℃時，培養(yǎng)基的pH變化不應超過0.2個pH單位。一般使用大約濃度為40g/L（約1mol/L）氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液進行培養(yǎng)基pH的調整。值得注意的是，商品化的培養(yǎng)基在高壓滅菌前后的pH可能變化很大，但使用質量好的蒸餾水或去離子水配制時，滅菌前并不需要調節(jié)pH。（4）分裝

將配制好的培養(yǎng)基分裝到適當?shù)娜萜髦?，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內，分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的2/3在試管內，1/3在試管外。分裝容器應預先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。此外還須用防水紙包扎（目前試管一般多有用螺旋蓋，采用金屬或塑料試管帽），分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為恰當。每批培養(yǎng)基應另外分裝20mL培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，作為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。但有些特殊培養(yǎng)基（如嗜鹽瓊脂培養(yǎng)基、MKTTn、科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基等）只能煮沸滅菌。煮沸后應迅速冷卻，避光保存；明膠、血清、糖類等不耐高溫的物質，應采取高壓鍋低溫滅菌法（間歇滅菌法）滅菌；有些試劑不需滅菌，可以直接使用（參見相關國際標準或供應商使用說明）。所有培養(yǎng)基濕熱或過濾滅菌后,必須進行監(jiān)測,尤其是要對pH、顏色、無菌效果和均勻性等指標進行監(jiān)測。（6）滅菌

制備含有有毒物質的添加成分（尤其是抗生素）時，需要特別小心（必要時在通風櫥內操作），避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發(fā)生其他不良反應。制備溶液時要特別小心并按產(chǎn)品使用說明操作，不要使用過期的試劑。對于抗生素工作溶液，應當現(xiàn)用現(xiàn)配。在特定環(huán)境下，抗生素溶液應適量分裝后冷凍儲存，但解凍后的溶液不能再次冷凍，生產(chǎn)廠商應提供冷凍對抗生素活性影響的有關資料，也可由使用者自行測定。（7）添加成分的制備培養(yǎng)基的使用(1)瓊脂培養(yǎng)基的融化將培養(yǎng)基放到沸水浴中或使用有相同效果的方法（如高壓鍋中的蒸汽）使之融化。經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基盡量減少加熱時間以保證培養(yǎng)基的質量。避免過度加熱，培養(yǎng)基融化后即可將其從加熱器上取下，放入47℃±2℃的恒溫水浴鍋中冷卻，直至使用。融化后的培養(yǎng)基應盡快使用，放置時間一般不應超過4h。(2)培養(yǎng)基的脫氣必要時，將培養(yǎng)基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min，加熱時松開容器的蓋子；加熱后蓋緊蓋子，迅速冷卻至使用的溫度。(3)添加成分的加入對熱不穩(wěn)定的添加成分應在培養(yǎng)基冷卻至47℃±2℃時再加入。在加入滅菌的添加成分前，先放置到室溫，避免冷的液態(tài)造成瓊脂凝結或形成片狀物。將加入培養(yǎng)基的所有添加物緩慢充分混勻，然后盡快分裝到要使用的容器中。(4)培養(yǎng)基斜面和平板培養(yǎng)基的制備和儲存瓊脂斜面培養(yǎng)基應在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則應垂直放置至冷凝。制備平板培養(yǎng)基，將融化的培養(yǎng)基傾注到平皿中，使之在平皿中形成一個至少2mm厚的瓊脂層（對于直徑90mm的平皿，通常需要加入15mL瓊脂培養(yǎng)基）。將平皿蓋好蓋子后放到一個涼的水平平面使瓊脂冷卻凝固。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基會損失水分，當水分損失的量大于培養(yǎng)基總量的15％時，就會影響微生物的生長。

凝固后的培養(yǎng)基應立即使用或存放于暗處和（或）放在4℃～12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周或按廠商提供的標準執(zhí)行。在平板底部做好標記，標記的內容包括制備日期和（或）有效期和名稱，也可以使用培養(yǎng)基的編碼系統(tǒng)進行標記。將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長儲存期限。為了避免產(chǎn)生冷凝水，平板應冷卻后再裝入袋中。儲存前不要對瓊脂培養(yǎng)基表面進行干燥處理。對于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，應先對瓊脂表面進行干燥；干燥時，將平板蓋揭開，將平板倒扣于烘箱（培養(yǎng)箱）中（溫度設為20℃～50℃），或放在有對流風的無菌凈化臺中，直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥，商業(yè)化的平板瓊脂培養(yǎng)基應按照廠商提供的說明操作。(5)培養(yǎng)培養(yǎng)時每垛最多堆放6個平板，平板間要留有空隙以進行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達到一致。對于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溫度與培養(yǎng)箱達到一致取決于很多因素，如體積、內容物量、容器類型、培養(yǎng)類型等。在使用厭氧罐時，有時堆放的平板數(shù)可以超過6個。(6)培養(yǎng)基的棄置所有污染的和未使用的培養(yǎng)基的棄置應采用安全的方式，而且要符合國家和地方法規(guī)的規(guī)定。成品的質量控制

(1)物理質量的控制實驗室測試至少應包括以下內容：20℃～25℃時的pH；

觀察以下內容：加入培養(yǎng)基的量和（或）瓊脂層的厚度；色澤；透明度和（或）是否存在肉眼可見的雜質；凝膠穩(wěn)定性（粘稠度）和濕度。(2)微生物指標控制A.污染檢測：在每批制備好的培養(yǎng)基選取部分樣品進行污染測試。B.測試菌株：具有代表性的穩(wěn)定特征并能有效證明實驗室培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株。測試菌株主要購于標準菌株保藏中心，也可以是實驗室自己分離的具有良好特性的菌株。最好使用從事品種分離的菌株。包括：陽性菌株、陰性菌株等。C.即用培養(yǎng)基和試劑：應由商品化即用培養(yǎng)基的生產(chǎn)廠，向使用者提供相應的資質證明。使用者就不必對培養(yǎng)基進行大量的培養(yǎng)基測試工作，但應保證其儲存條件。D.商品化合成脫水培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)基：對于每批制備好的培養(yǎng)基，除用有效菌株進行測試外，還應用實際樣品進行檢測，以更好地證明。不含指示劑的培養(yǎng)基，只需用陽性測試菌株進行檢測。含有指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，應使用能證明其指示或選擇作用的菌株進行試驗。復合培養(yǎng)基（即需要加入添加成分的培養(yǎng)基）需要用具備有效性能的菌株逐批進行驗證，對實驗室制備的需加入添加成分的現(xiàn)成培養(yǎng)基同樣適用。1.SN/T1538.1-2005培養(yǎng)基制定指南第一部分：實驗室培養(yǎng)基制備質量保證通則。2.ISO/TS11133.1-2000食品和動物飼料的微生物學培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)導則第1部分實驗室培養(yǎng)基制備的質量保證一般導則3.SN/T1538.2-2007培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南。本部分標準規(guī)定了培養(yǎng)基的通用質量控制要求并列舉了固體和液體培養(yǎng)基的性能測試方法。本部分標準適用于市售和自制培養(yǎng)基的性能測試。三、微生物的分離、純化與接種技術接種工具和方法在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。

接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

微生物的分離、純化與接種技術劃線接種：這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。劃線接種，分離純化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies灼燒微生物的分離、純化與接種技術斜面接種技術微生物的分離、純化與接種技術

－－細菌的涂布分離技術微生物的分離、純化與接種技術

－－液體接種法、穿刺接種液體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時要求無菌操作。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵——搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學或生物學的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴格厭氧的微生物，要用化學和物理并用的方法。在進行厭氧培養(yǎng)時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實驗室中常用的如葡萄糖——美蘭指示劑。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡易，但厭氧程度低?；瘜W方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應時吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達到嚴格厭氧目的，常采用物理和化學相結合并用的方法。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006NNaOH0.015%美蘭溶液6％葡萄糖溶液上列三種溶液在使用時等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗?。微生物細胞大小和?shù)量的測定目的要求：學習使用目鏡測微尺和鏡臺測微尺在顯微鏡下測定微生物大小的方法；學習使用血球記數(shù)板測定微生物數(shù)量的方法。實驗材料：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、細菌染色片、血球記數(shù)板、酵母菌懸液、蓋玻片、無菌滴管、西水紙、擦鏡紙、香柏油、二甲苯測定微生物的大小測定的工具：目鏡測微尺鏡臺測微尺測定微生物的大小目鏡測微尺的校正：在高倍鏡下，看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使目鏡測微尺的0點與鏡臺測微尺的某一刻度重合，然后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度。計算兩刻度間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。由于鏡臺測微尺的刻度每格長10μm，所以可得：目鏡測微尺每格長度（μm）=（鏡臺測微尺格數(shù)×10）/目鏡測微尺格數(shù)

注意：校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的接物鏡、接目鏡、鏡筒長度等）進行，而且只能在這特定的情況下才可重復使用。菌體大小的測定：取下鏡臺測微尺，將細菌染色標本置于載物臺上，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的長和寬。測定微生物數(shù)量方法：活菌計數(shù)法——平板菌落計數(shù)法；總菌計數(shù)法——血球計數(shù)板或霍瑟（PeroffHausser）細菌計數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。

測定微生物數(shù)量本實驗用血球計數(shù)板計數(shù)酵母菌的數(shù)量取清潔無油的血球計數(shù)板，在計數(shù)室上面加蓋玻片。取酵母菌液，搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，計數(shù)室內不得有氣泡。靜止5min后，用低倍鏡觀察并將計數(shù)室移至視野中央。高倍鏡下計數(shù)：隨機計數(shù)五個中格的平均值，然后求得每個中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的總菌數(shù)，最后再換算到每mL菌液中的含菌數(shù)。計算方法：注意事項：壓在方格線上的菌體，以壓在底線和右側線上的菌體計入本格內；遇到有芽體的酵母時，若芽體和母體同等大，就按單個酵母計數(shù)。計數(shù)完畢后，血球計數(shù)板要立即清洗干凈，并用吸水紙吸干，最后用擦鏡紙擦干凈，并放回盒內。（X1+X2+X3+X4+X5）5×25（或16）×10×1000×

稀釋倍數(shù)酵母菌細胞數(shù)/mL=細菌生理學檢查法

－－微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長出孢子，貼上標簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3個月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。方法簡便，實驗室均采用。

缺點：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化。石蠟封藏法：在已長好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細菌和放線菌。石蠟的處理：250mL三角瓶裝100mL液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。砂土管保藏法：(可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細菌）。1.砂土管的制備：取河沙若干，用40目過篩，出去大顆粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有機質（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最后倒去酸水，用自來水沖洗至中性，烘干備用。另取0.3m以下非耕作層的瘦黃土若干，曬干磨細，過120目篩。2.按土：砂＝1：4的比例均勻混合，裝入指形管中，以1cm高為宜，塞上棉塞，160～1700C干熱滅菌2h。3.在新鮮菌種斜面上加入3mL左右的無菌水，用無菌接種環(huán)制成菌懸液，用無菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌懸液放入每個砂土管中，用接種環(huán)拌勻，并貼上標簽，注明菌名。4.菌液加好后，立即進行抽真空干燥，要求在24h內抽干，尤其是夏天要求較短時間內抽干。搖散砂土，放干燥器內冰箱保藏。冷凍真空干燥保藏法：此法一般常用于細菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護劑?！?接種、分離純化4.1接種

將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內的過程叫做接種。

4.1.1接種工具1．接種針

2.接種環(huán)

3.接種鉤

4.5.玻璃涂棒

6.接種圈

7.接種鋤

8.小解剖刀

圖4-1

接種和分離工具4.1.2無菌操作

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

接種時，打開培養(yǎng)皿的時間應盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。

平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養(yǎng)皿內倒培養(yǎng)基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。4.2接種法與純培養(yǎng)的分離技術含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixedculture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。

4.2.1平板劃線分離培養(yǎng)法

平板劃線分離培養(yǎng)法，用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進行劃線，使培養(yǎng)物中混在的多種細菌在培養(yǎng)基表面分散生長，各自形成菌落，根據(jù)菌落的形態(tài)及特征，挑選單個菌落，經(jīng)過移種而獲得純種細菌（純培養(yǎng)）。分離細菌的方法很多，最常用的是平板劃線分離法。根據(jù)劃線的方式不同有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖4-2）

圖4-2平板劃線分離法

1.斜線法

2.曲線法

3.方格法

4.放射法

5.四格法

1.曲線劃線分離法1)先將接種環(huán)火焰滅菌,待冷后取培養(yǎng)物少許;2)左手拿起平板，以中指為支點，并用拇指和食指將平板蓋打開；3)右手迅速將取有培養(yǎng)物的接種環(huán)從打開的空間插入平板內，使接種環(huán)與培養(yǎng)基表面呈45℃角，在酒精燈上方5~6cm處劃線接種。先在平板上1/5處輕輕涂布，然后即可左右來回以曲線形式作連續(xù)劃線接種，線與線間留有適當距離，將整個平板表面劃滿曲線；4)注明標識后，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般在18~24小時后觀察結果。2.斜線(分區(qū))劃線分離法1)用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線,再在2、3……區(qū)依次劃線。2)每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域。3)每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線1~2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個菌落。4)其他操作與上述曲線劃線分離法相同。斜線接種示意圖3.方格劃線法

將培養(yǎng)物涂布于平板上1/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自1/5劃線處作平行劃線5~6條，將接種環(huán)滅菌后，劃垂直線5~6條，使呈正方形格。其他操作同前。

細菌在固體培養(yǎng)基表面只能在固定的地方生長繁殖，經(jīng)過一定的培養(yǎng)時間后，可形成肉眼可見的菌落。菌落中只含有一種細菌，而每種細菌的菌落各有其特征。菌落形態(tài)往往有助于初步識別細菌；還可以由此獲得細菌而進行一系列的鑒定。

識別菌落的能力是從事微生物檢驗人員的極為重要的基本功。菌落形態(tài)觀察1)大小:以mm表示。菌落的大小隨細菌種類、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間等條件而不同。同一種細菌在同一平板上，在密集處的菌落比疏散處小。因此，表示菌落大小時，應注明培養(yǎng)基名稱。一般以培養(yǎng)18~24小時后，選散在處的菌落大小。1mm左右為小菌落；2~3mm為中等大；3mm以上為大菌落。2)形狀及邊緣：圓形、不規(guī)則、放射狀、樹根狀、邊緣整齊、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有無光澤等。

圖4-3細菌的培養(yǎng)特征1.點狀2.圓形3.絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平8.隆起9.凸起10.墊狀11.臍狀

12.邊緣整齊13.波狀14.裂片狀15.嚙蝕狀16.絲狀17.卷發(fā)狀

18.絲線狀19.刺毛狀20.串珠狀21.疏展狀22.樹根狀23.假根狀

24.絲狀25.串珠狀26.乳頭狀27.絨毛狀28.樹根狀29.量杯狀30.蘿卜狀31.漏斗狀32.囊狀33.層狀34.絮狀35.環(huán)狀36.蹼狀37.膜狀5)構造:均勻、露滴狀、顆粒狀、發(fā)狀、皺招狀等。6)顏色：無色、白色、灰色、灰白色或乳白色、熒光綠、金黃色、檸檬