第二章連接酶及其他(二)

第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶的基本性質(zhì)1.修復(fù)雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵432.修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上切口處的磷酸二酯鍵一、DNA連接酶的基本性質(zhì)44一、DNA連接酶的基本性質(zhì)3.連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：注意：（1）DNA連接酶只能連接相鄰核苷酸之間的切口（nick）；（2）如果是缺少一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的裂口（gap），DNA連接酶是無(wú)法連接的；46（3）DNA連接酶不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA連接酶催化的連接反應(yīng)是需要能量的：在大腸桿菌或其他細(xì)菌中，利用NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），在動(dòng)物細(xì)胞中及噬菌體中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注意：47

T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶

T4噬菌體RNA連接酶二、DNA連接酶的種類(lèi)

T4噬菌體DNA連接酶該酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，是T4噬菌體基因30編碼的產(chǎn)物，分子量為68ku，需要ATP作為輔助因子。兩個(gè)帶有互補(bǔ)粘性末端的雙鏈DNA分子一條帶有切口的雙鏈DNA分子兩個(gè)帶有平頭末端的雙鏈DNA分子DNA-RNA雜合體分子中切口該酶可連接49

大腸桿菌DNA連接酶該酶是從正常的大腸桿菌中提取的，由大腸桿菌基因組中l(wèi)ig基因編碼，分子量為75ku，需要NAD+作為輔助因子。具有同源互補(bǔ)粘性末端的不同DNA分子一條帶有切口的雙鏈DNA分子該酶可連接但,該酶幾乎不能催化兩個(gè)平頭末端DNA分子的連接T4噬菌體DNA連接酶該酶在DNA體外重組中比大腸桿菌DNA連接酶應(yīng)用廣泛(既能連接粘性末端,也能連接平頭末端).兩種酶各自的優(yōu)點(diǎn)大腸桿菌DNA連接酶:該酶的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌后,假陽(yáng)性背景低(由于它對(duì)DNA末端的要求比較嚴(yán)格-----互補(bǔ)粘性末端).52

T4噬菌體RNA連接酶T4噬菌體RNA連接酶由T4噬菌體基因63編碼,需要ATP作為輔助因子.連接反應(yīng):主要用途:

對(duì)RNA進(jìn)行3′末端標(biāo)記,即將32P標(biāo)記的3′,5′-二磷酸單核苷加到RNA的3′端.該酶可催化單鏈DNA或RNA的5′磷酸與相鄰的3′羥基、單核苷酸共價(jià)連接.53第三節(jié)DNA聚合酶一、DNA聚合酶的分類(lèi)根據(jù)DNA聚合酶所使用模板的不同,可分為:依賴于DNA的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段酶T4噬菌體DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶55

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.DNA聚合酶的分類(lèi)目前,從大腸桿菌中已分離出3種DNA聚合酶,分別為:DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ:與DNA復(fù)制有關(guān)主要參與DNA的修復(fù)分子克隆中常用DNA聚合酶Ⅰ2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質(zhì)

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ是Kronberg等1956年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)DNA聚合酶,故也稱為Kronberg酶.①

5′3′DNA聚合酶活性

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)發(fā)揮聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。572.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質(zhì)②

3′5′核酸外切酶活性

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ該活性識(shí)別單鏈，能將復(fù)制過(guò)程中3′端的錯(cuò)配堿基切除，從而保證DNA復(fù)制的高保真度，也稱為校對(duì)功能。DNApolⅠ5′3′5′58③

5′3′核酸外切酶活性

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質(zhì)5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'

-P5'3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'

-P5′3′外切核酸酶活性的水解作用有3個(gè)特征：

待切除的核酸分子必須具有5′端磷酸基團(tuán)。核苷酸分子被切除前位于已配對(duì)的DNA雙螺旋區(qū)段上。

被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是RNA.③

5′3′核酸外切酶活性2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質(zhì)2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的用途合成ds-cDNA第二鏈（Doublestranded)

雜交探針的制備

DNA序列分析在DNA聚合反應(yīng)體系中，如果加入放射性核素標(biāo)記的核苷酸，則這些標(biāo)記的核苷酸將取代原來(lái)的核苷酸殘基，產(chǎn)生帶標(biāo)記的DNA分子，這就是所謂的DNA分子雜交探針(書(shū)P36）。雜交探針的制備過(guò)程:3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′************5′5′3′*****DNAaseⅠE.ColiDNApolⅠ*dNTP圖切口平移反應(yīng)原理62

Klenow片段1.Klenow片段的由來(lái)E.coliDNApolⅠ蛋白酶較小片段較大片段(Klenow片段)5′3′3′5′聚外合切酶酶活活性性性質(zhì)5′3′外切酶活性

Klenow

片段的由來(lái)通常所用的Klenow片段是由枯草桿菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成,或是經(jīng)過(guò)克隆產(chǎn)生的一條多肽鏈。

Klenow片段

Klenow片段2.Klenow片段的用途填補(bǔ)由DNA限制酶反應(yīng)產(chǎn)生的凹陷3′末端。用[32P]dNTP填補(bǔ)凹陷的3′末端，即DNA分子的末端標(biāo)記（書(shū)P32）。在cDNA克隆出來(lái)后，合成cDNA第二條鏈。用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA序列分析等。65

T4DNA聚合酶1.T4DNA聚合酶的性質(zhì)T4DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow片段高100~1000倍與Klenow片段不同具有5′3′聚合酶活性具有3′5′外切酶活性與Klenow片段相同不具有5′3′外切酶活性66

T4DNA聚合酶2.T4DNA聚合酶的用途填補(bǔ)或標(biāo)記由限制酶切割DNA后產(chǎn)生的凹陷3′末端，標(biāo)記反應(yīng)時(shí)需要高濃度的dNTP，以保證聚合反應(yīng)（填補(bǔ)）大于3′5′核酸外切酶活性。進(jìn)行3′突出末端的DNA末端標(biāo)記。67

T4DNA聚合酶2.T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記用作雜交探針的DNA片段。

由3′5′核酸外切酶活性部分酶切雙鏈DNA，得到凹缺3′末端用[32P]dNTP填補(bǔ)（取代合成）。

將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成平頭末端。

利用T4DNA聚合酶的3′5′核酸外切酶活性從雙鏈DNA上切除突出3′末端，在高濃度dNTP中模板上雙鏈區(qū)的降解與合成達(dá)到平衡。68

TaqDNA聚合酶1.來(lái)源TaqDNA聚合酶最初是從耐熱細(xì)菌Thermusaqraticus中純化而得，因此是一種單亞基耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶，現(xiàn)已廣泛用于基因工程的操作中。69

TaqDNA聚合酶702.性質(zhì)

具有5′3′聚合酶活性最適反應(yīng)溫度為75℃~80℃（據(jù)目的序列不同而不同）

TaqDNA聚合酶在60℃時(shí)其聚合酶活性下降2倍，在37℃時(shí)下降10倍。

TaqDNA聚合酶3.用途TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），在體外擴(kuò)增特定的DNA片段，DNA或單鏈cDNA都可作為起始模板。但在使用中應(yīng)注意：①TaqDNA聚合酶需要Mg2+。②磷酸緩沖液抑制該酶活性，應(yīng)避免使用。71

逆轉(zhuǎn)錄酶一、一般知識(shí)

依賴于RNA的DNA聚合酶或RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。分子量約為16萬(wàn)，由分子量分別為6.2萬(wàn)和9.5萬(wàn)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的亞單位組成。72

逆轉(zhuǎn)錄酶二、來(lái)源逆轉(zhuǎn)錄酶最主要的來(lái)源是鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞性白血病病毒（AMV）。三、特性AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性首先表現(xiàn)為DNA聚合酶的活性.

模板既可以是DNA,也可以是RNA.在以RNA為模板是稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性,而以DNA為模板是則叫做DNA為指導(dǎo)的DNA聚合酶.73

逆轉(zhuǎn)錄酶三、特性

AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性其次表現(xiàn)為RNaseH活性。此酶可以特異性降解RNA-DNA雜種雙鏈中的RNA部分。另外，還具有DNA內(nèi)切酶活性和核酸結(jié)合活性。74

逆轉(zhuǎn)錄酶四、用途逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可將任何真核基因的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA拷貝,然后構(gòu)建克隆,大量擴(kuò)增,并表達(dá)這種基因,從而為真核基因的研究與其核遺傳工程提供了一項(xiàng)必不可少的手段。75一、性質(zhì)末端轉(zhuǎn)移酶催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3′-OH末端。這很像DNA聚合酶通過(guò)5′3′聚合5′-脫氧核苷三磷酸合成一條DNA鏈。所不同的是末端轉(zhuǎn)移酶不需要模板。第四節(jié)末端轉(zhuǎn)移酶76二、用途主要用途是給載體和外源DNA分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以便二者在體外連接。進(jìn)行DNA3′-OH末端標(biāo)記。標(biāo)記物可以是放射性的，如α-32P-dNTP,也可以是非放射性的,如生物素-11-dUTP（生物素和親和素）,它們可用于DNA序列分析、DNaseⅠ足跡分析、分子雜交等實(shí)驗(yàn)中。77二、用途進(jìn)行同聚物接尾

用末端轉(zhuǎn)移酶給一群DNA分子3′-OH末端接上oligo（dA）或（dG）,給另一群DNA分子3′-OH末端接上oligo（dT）或（dC）,混合這兩群分子,就能使末端轉(zhuǎn)移酶接上的同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。這種方法稱為同聚物接尾法。78第五節(jié)核酸酶核酸酶是一類(lèi)能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中應(yīng)用非常廣泛。根據(jù)核酸酶對(duì)底物作用的專一性，可將其分為三類(lèi)：核糖核酸酶（RNase）：只作用于RNA。脫氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于DNA。核酸酶（nuclease）：既作用于DNA，又作用于RNA。79一、核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ

）

exoⅦ是一種的單鏈核酸外切酶，它能夠從5′末端或3′末端降解DNA分子，產(chǎn)生出寡核苷酸短片段，且不需要Mg2+的參與。二、核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ

）

該酶可以從雙鏈DNA的3′-OH末端起逐一切去5′單核酸,其作用底物為含切口或缺口的線性雙鏈DNA和開(kāi)環(huán)DNA。作用后在雙鏈DNA上形成一條長(zhǎng)的單鏈區(qū),這種外切酶不能降解單鏈DNA和帶突出3′末端的雙鏈DNA。81二、核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ

）三、核酸酶S1

1.基本知識(shí)核酸酶S1是從米粉狀曲菌（Aspergillusoryzae）提取帶的一種金屬蛋白，分子量32000（32ku），相對(duì)耐熱，催化反應(yīng)通常需要Zn2+和酸性條件，產(chǎn)生帶5′磷酸的寡核苷酸。832.特性降解單鏈DNA或RNA,包括雙鏈分子中的單鏈區(qū)域(如發(fā)夾結(jié)構(gòu)),這種單鏈區(qū)域甚至可以小到1個(gè)堿基對(duì)的程度。降解單鏈DNA的速度比RNA的速度快10倍。降解發(fā)應(yīng)的方式為內(nèi)切和外切。降解發(fā)應(yīng)的最適pH為4.0～4.5。酶量過(guò)大時(shí)，伴有雙鏈核酸的降解，該酶的雙鏈降解活性僅為單鏈的1/750