植物細(xì)胞工程課件

細(xì)胞工程（二）一、植物細(xì)胞工程（一）、植物細(xì)胞工程理論基礎(chǔ)（二）、植物細(xì)胞的建立與培養(yǎng)（三）、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的步驟（四）、植物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生理特性（六）、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用（一）、植物細(xì)胞工程理論基礎(chǔ)及組織培養(yǎng)1細(xì)胞的全能性

細(xì)胞的全能性指：即單一的離體細(xì)胞在一定的環(huán)境條件下能分化成不同細(xì)胞組織的乃至整個(gè)植株的能力。動(dòng)物和植物細(xì)胞都可在一定的條件表現(xiàn)出全能性，其中最先發(fā)現(xiàn)的是植物細(xì)胞的全能性，植物細(xì)胞表現(xiàn)全能性要求的條件更容易達(dá)到。但不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng)；即使對(duì)于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個(gè)體。植物細(xì)胞全能性的差異根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導(dǎo)組織>厚壁組織。P702-2細(xì)胞脫分化與組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)(tissueculture)指通過無菌操作分離出植物體的一部分接種到培養(yǎng)基上，在人工控制條件下(包括溫度、濕度、光照等)進(jìn)行培養(yǎng)的過程。外植體(explant)：通常指被培養(yǎng)的上述植物離體部分。p69脫分化：植株上已經(jīng)分化的細(xì)胞或組織離體后在培養(yǎng)條件下逐漸恢復(fù)到分生狀態(tài)的過程。愈傷組織：細(xì)胞脫分化的結(jié)果通常是形成愈傷組織（未分化的細(xì)胞團(tuán)）。已經(jīng)脫分化的細(xì)胞或組織在一定條件下，它們又可以經(jīng)過胚狀體(由體細(xì)胞形成的類似合子胚的結(jié)構(gòu))或愈傷組織再分化出芽和根，從而發(fā)育成一個(gè)完整的植株，因?yàn)樵诩?xì)胞的基因中，除了全套的結(jié)構(gòu)基因外，還有操縱基因，使結(jié)構(gòu)基因不能啟動(dòng)而無法工作。激素則是在一定條件下能打破操縱基因的控制，使結(jié)構(gòu)基因活化。因此，它直接影響和控制細(xì)胞的分化。（二）、植物細(xì)胞的建立與培養(yǎng)1、組織培養(yǎng)的基本步驟（1）、試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備和清洗、消毒等準(zhǔn)備試驗(yàn)材料，即一般為植物器官的外植體清除材料內(nèi)部的微生物不能損害試驗(yàn)材料（2）、準(zhǔn)備培養(yǎng)基培養(yǎng)基是指人工配制的含有營養(yǎng)物質(zhì)供培養(yǎng)物生長(zhǎng)分化的介質(zhì)。通常含無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)(大量元素和微量元素)、碳源(1%-4%蔗糖)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2，4-D或NAA、KT或6-BA)以及有機(jī)附加物(維生素、甘氨酸)等幾類物質(zhì)組成。P71～73自然條件下：通過內(nèi)源生長(zhǎng)因子、特別是植物生長(zhǎng)素的釋放，也能激發(fā)細(xì)胞分裂產(chǎn)生愈傷組織人工條件下：在生長(zhǎng)素（高濃度）和細(xì)胞分裂素（低濃度）作用下，外植體經(jīng)誘導(dǎo)生成愈傷組織。愈傷組織類型：——結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽——結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立（5）、誘導(dǎo)產(chǎn)生器官或體細(xì)胞胚器官產(chǎn)生：愈傷組織形成細(xì)胞團(tuán)——器官原基——形成器官（先芽后根）體細(xì)胞胚：具有兩極性，可一次性再生完整植株。（6）、移栽1）愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)2）從愈傷組織到細(xì)胞株調(diào)節(jié)培養(yǎng)基營養(yǎng)組織營養(yǎng)成分組成，愈傷組織在傳代培養(yǎng)若干代后，產(chǎn)生細(xì)胞群，該細(xì)胞群能適應(yīng)進(jìn)一步的的懸浮培養(yǎng)，從而建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞系1步驟選擇細(xì)胞株，一般選擇次生代謝物含量高的植物種類、品種或某一高產(chǎn)植株，利用外植體誘導(dǎo)出愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)株，并從中篩選出目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量高、性能優(yōu)良的無性繁殖系。擴(kuò)大培養(yǎng)，即把選出的“種子”接種到通氣攪拌罐或進(jìn)一步放大到幾百升至幾立方米的生物培養(yǎng)器中。（三）植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的步驟注意：由于植物細(xì)胞培養(yǎng)的目標(biāo)產(chǎn)物都屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，要在細(xì)胞生長(zhǎng)的后期才開始合成。因此，為了讓產(chǎn)物產(chǎn)量高，一般采用二步培養(yǎng)法：即使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基使細(xì)胞大量增殖，達(dá)到了一定的細(xì)胞密度，然后再改用適合細(xì)胞產(chǎn)物積累的培養(yǎng)基，促進(jìn)細(xì)胞啟動(dòng)次級(jí)代謝途徑并提高產(chǎn)物的產(chǎn)量2培養(yǎng)條件（1）物理因素光：根據(jù)植物細(xì)胞而定溫度：25℃左右PH值：5～6（2）化學(xué)因素溶氧：植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是好氧過程，但植物細(xì)胞的呼吸率低。選擇合適溶氧度培養(yǎng)基：有機(jī)碳源、含氮鹽類（有時(shí)加入有機(jī)氮）、植物激素（IAA和2，4－D等）（四）、植物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生理特性1.在自然狀態(tài)下，植物之間通過“細(xì)胞間連絲”實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的聯(lián)系與接觸。這種接觸對(duì)于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)同樣重要，所以，植物細(xì)胞離體懸浮培養(yǎng)需要保持一定的聚集度，適當(dāng)保持細(xì)胞的尺寸。與微生物發(fā)酵相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)需要注意的方面為：細(xì)胞尺寸、對(duì)剪氣力的敏感性，沉降性、生長(zhǎng)速率、次級(jí)代謝物的合成特點(diǎn)和細(xì)菌污染等3.植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化存在的問題生長(zhǎng)緩慢次級(jí)代謝物含量低培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等多數(shù)產(chǎn)物積累于胞內(nèi)不耐受剪切力一般的說，只有當(dāng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的價(jià)格高于1000美元/kg時(shí)，才考慮采用植物細(xì)胞培養(yǎng)方法。（五）、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1利用植物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行藥物生產(chǎn)太平洋紫杉細(xì)胞生產(chǎn)抗癌藥物——紫杉醇、人參細(xì)胞培養(yǎng)人參皂苷和人參多糖、毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化毛地黃毒苷典型案例：紫杉醇生產(chǎn)案例紫杉醇(Paclitaxel)是繼阿霉素和鉑類抗癌藥之后本世紀(jì)后期最受人們重視的一種抗癌新藥，是一新發(fā)現(xiàn)的有絲分裂抑制劑，其作用機(jī)理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細(xì)胞的復(fù)制受到阻斷而凋亡。1967年美國化學(xué)家Wall和Wani等首先從太平洋紫杉（短葉紅豆杉，Taxus.brevifolia）樹皮中提取出來。該藥于1990年進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，1992年底獲美國FDA批準(zhǔn)上市。日本有關(guān)組織從紅豆杉中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，篩選得到細(xì)胞培養(yǎng)4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量達(dá)到了0.05％，比樹皮中紫杉醇的含量高達(dá)10倍。Ketchum從6種紫杉醇屬植物中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，獲得了產(chǎn)生紫杉醇的高產(chǎn)細(xì)胞株，在懸浮培養(yǎng)下，細(xì)胞內(nèi)的紫杉醇含量超過了20mg/L。清華大學(xué)化工系生物化工研究所通過固液兩步培養(yǎng)法可以在4周內(nèi)獲得20g/L干物質(zhì)，利用代謝調(diào)控技術(shù)在2~3天內(nèi)將紫杉醇的含量提高到0.063%左右。2、利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)天然色素典型案例——紫草寧1974年Tabata等就研究了用于培養(yǎng)紫草細(xì)胞的培養(yǎng)基。11981年Tabata和Fujita等又用大的培養(yǎng)容器進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)并獲得了紫草寧衍生物。日本在1983年進(jìn)行紫草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)紫草寧。我國南京大學(xué)等從1986年開始對(duì)該項(xiàng)目進(jìn)行研究，在進(jìn)行大量的研究之后得出，在適當(dāng)?shù)臈l件下，培養(yǎng)的紫草細(xì)胞懸浮物中紫草寧含量占干重的14%，比紫草根中的含量高10倍。二、轉(zhuǎn)基因植物（一）、轉(zhuǎn)基因生物的概念（二）、轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法（三）、轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用（四）、轉(zhuǎn)基因植物的安全性（一）、轉(zhuǎn)基因生物的概念轉(zhuǎn)基因生物：將一種生物的基因?qū)肓硪环N生物,定向改造生物,定向改造生物,使之向著有利于人類需要的方向發(fā)展。世界第一例轉(zhuǎn)基因植物———煙草1983年在美國問世。1986年,首批轉(zhuǎn)基因植物———抗蟲和抗除草劑棉花進(jìn)入田間試驗(yàn)。1992年中國成為世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物商品化種植的國家，開創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因植物商品化應(yīng)用的先河；當(dāng)時(shí)種植的是一種抗黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草。（二）、轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建方法1農(nóng)桿菌導(dǎo)入法對(duì)象：雙子葉植物、部分裸子植物和少數(shù)單子葉植物。過程：先將帶有目的基因的質(zhì)粒整合到農(nóng)桿菌基因組中，再將此農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共同培養(yǎng)36～48h，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，然后分離洗滌去菌后通過組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植物或形成冠癭瘤和發(fā)狀根等組織，這些組織也就是一種天然的選擇標(biāo)記。2基因槍法：金屬微粒表面附著含有目的基因的DNA分子，經(jīng)過加速處理，轟擊植物細(xì)胞，將DNA直接注射入植物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率可達(dá)8％～10％。3花粉管通道法：將目的基因整合后，在植株開花時(shí)利用花粉管通道直接導(dǎo)入受體植株。4原生質(zhì)融合法：去細(xì)胞壁植物細(xì)胞而得原生質(zhì)體，然后用帶有目的基因的載體去轉(zhuǎn)化此原生質(zhì)體，再通過篩選，得到轉(zhuǎn)基因植物。（三）、轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用1、轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用就是利用生物技術(shù)將某些外源生物的基因轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物中去，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在性狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面符合人類所需要的方向轉(zhuǎn)變。如果以轉(zhuǎn)基因植物得到的產(chǎn)品為直接食品或原料加工生產(chǎn)的食品就是轉(zhuǎn)基因食品。對(duì)于農(nóng)作物本身，目前直接提高產(chǎn)量還比較困難，主要是構(gòu)建那些具有抗病、抗蟲、抗病毒和抗除莠劑能力的轉(zhuǎn)基因植物。因?yàn)榭剐远际怯袉蝹€(gè)基因所控制的。另外，還可改變農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量，比如提高蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量，改變油脂的組成，延長(zhǎng)果品的保險(xiǎn)期等。1）抗除草劑基因工程。將具有除草作用的酶和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)進(jìn)植物，使其拷貝大大增加以除草劑為底物的酶的基因轉(zhuǎn)移到植物中利用基因突變技術(shù)使除草劑識(shí)別和作用特定位點(diǎn)的氨基酸基因位點(diǎn)突變2）抗蟲基因工程：根據(jù)抗蟲基因的來源，可從細(xì)菌中、植物組織中和動(dòng)物體內(nèi)分離出相關(guān)抗性基因，再轉(zhuǎn)入植物中去。3）抗逆基因工程：包括抗旱、抗寒、抗熱和抗鹽等方面2.轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗，如乙型肝炎表面抗原轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)點(diǎn)：（1）易形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模；（2）價(jià)格便宜；（3）安全；（4）使用方面不足之處：轉(zhuǎn)基因植物中重組蛋白含量低植物外源蛋白的提取和純化還沒有達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平，還停留在實(shí)驗(yàn)室水平。（四）、轉(zhuǎn)基因植物的安全性從理論上講，轉(zhuǎn)基因技術(shù)和常規(guī)雜交育種都是通過優(yōu)良基因重組獲得新品種的，但常規(guī)育種是模擬自然現(xiàn)象進(jìn)行的，基因重組和交流的范圍僅限于種內(nèi)近緣種間，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)則可以把任何生物甚至是人工合成的基因轉(zhuǎn)入植物中。人們無法預(yù)測(cè)將基因轉(zhuǎn)入一個(gè)新的遺傳背景中會(huì)是何種結(jié)果，故而產(chǎn)生很多疑慮，主要是關(guān)注其食品安全性和生態(tài)安全1、食品安全性安全問題轉(zhuǎn)基因食品中的外源基因?qū)θ梭w有無毒性轉(zhuǎn)基因植物食品中的外源基因是否發(fā)生轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因植物中外源基因編碼蛋白對(duì)人體是否有害轉(zhuǎn)基因植物食品中的抗生素標(biāo)記基因編碼蛋白是否會(huì)使食用者產(chǎn)生抗生素抗藥性轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的次生效應(yīng)問題2、生態(tài)安全性問題轉(zhuǎn)基因植物是否會(huì)演變成農(nóng)田雜草基因漂流到近源野生種的可能性昆蟲抗藥性的產(chǎn)生本章作業(yè)1簡(jiǎn)述動(dòng)物與植物細(xì)胞培養(yǎng)過程，并指出二者區(qū)別與聯(lián)系。2簡(jiǎn)述轉(zhuǎn)基因食品的利與弊激素：是生物體內(nèi)特殊組織或腺體產(chǎn)生的，直接分泌到體液中，通過體液運(yùn)送到特定作用部位，從而引起激動(dòng)效應(yīng)（調(diào)節(jié)控制各種物質(zhì)代謝和生理功能）的一群微量的有機(jī)化合物。植物激素是植物體內(nèi)合成的對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有顯著作用的幾類微量有機(jī)物質(zhì)。也被成為植物天然激素或植物內(nèi)源激素。它們?cè)谥参矬w內(nèi)部分器官合成后轉(zhuǎn)移到其它植物器官，能影響生長(zhǎng)和分化。在個(gè)體發(fā)育中，不論是種子發(fā)芽、營養(yǎng)生長(zhǎng)、繁殖器官形成以至整個(gè)成熟過程，主要由激素控制。在種子休眠時(shí)，代謝活動(dòng)大大降低，也是由激素控制的。

吲哚乙酸（IAA），在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強(qiáng)的生長(zhǎng)素。

赤霉素（GA）屬于雙萜化合物。促進(jìn)細(xì)胞分裂和莖的生長(zhǎng)等

細(xì)胞分裂素（CTK）是一類腺嘌呤衍生物。促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的分化等

脫落酸（ABA）是一種倍半萜衍生物。促進(jìn)休眠等。

乙烯是不飽和烴。促進(jìn)成熟和脫落等細(xì)胞激動(dòng)素是一種植物激素，屬細(xì)胞分裂素類。具有促進(jìn)細(xì)胞分裂，打