2023年微生物學(xué)實驗報告

微生物學(xué)實驗報告實驗一普通光學(xué)顯微鏡的使用及細菌染色與形態(tài)觀測第一部分:顯微鏡的使用一、目的規(guī)定1.熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、油鏡的使用原理和顯微鏡的維護方法。2.學(xué)會對的使用油鏡觀測細菌的基本形態(tài)和特殊構(gòu)造。３.了解各種顯微鏡的重要特性。二、實驗原理（一)光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造微生物實驗室中最常用的是普通光學(xué)顯微鏡，它的構(gòu)造可分為機械部分和光學(xué)部分。1、機械部分普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡的機械部分通常涉及以下幾個部分：目鏡、鏡筒、基座回轉(zhuǎn)器、物鏡、載物臺、光圈、聚光器、光源、鏡臂、細調(diào)節(jié)器、粗調(diào)節(jié)器等。2、光學(xué)部分:目鏡、物鏡、聚光器、光圈、光源。(二)放大倍數(shù)標本一方面經(jīng)物鏡放大,在目鏡的焦距平面上形成一個實像,再通過目鏡放大成最終的虛像?？偟姆糯蟊稊?shù)是物鏡放大倍數(shù)與目鏡放大倍數(shù)的乘積。物鏡的放大倍數(shù)愈大,其工作距離(物鏡鏡頭到標本片之間的距離)愈短，這時光圈就要打開得愈大。顯微鏡的放大倍數(shù)放大倍數(shù)總的放大倍數(shù)低倍鏡高倍鏡油鏡物鏡10×45×１00×目鏡10×１0×1０×10０×４５0×1000×(三）分辨距離與分辨力顯微鏡的性能受物鏡的分辨距離或分辨力所限制。分辨距離即透鏡所能分辨的兩個物點之間的最小距離，分辨距離愈小,透鏡的分辨力愈高,物像也就愈清楚。因此常以分辨距離來衡量顯微鏡的分辨力。Ｒ＝0.6１λ/N.A式中：Ｒ--－-－分辨距離；λ----－-作用光的波長；N．A---－-－數(shù)值口徑。一些介質(zhì)的折射率介質(zhì)折射率空氣水玻璃香柏油１１3５51.56三、實驗內(nèi)容材料：顯微鏡，香柏油，擦鏡紙。方法：細菌很小,須使用油鏡方可觀測到。油鏡是顯微鏡上最重要的部件之一,觀測時與玻片非常接近，稍不小心即可壓碎玻片,更嚴重的是損壞鏡頭,故必須極其仔細地學(xué)習(xí)油鏡的使用方法：1、為使低倍鏡取得最適之光源,可將低倍鏡頭調(diào)節(jié)到離載物臺約1cm的高度，將聚光器提高，光圈完全打開，然后調(diào)節(jié)電壓旋鈕至視野最合適。滴一滴香柏油，固定于載物臺上，用推動器調(diào)節(jié)到載物臺正中。在雙目側(cè)視下,下旋粗調(diào)節(jié)器,使油鏡頭浸入油中幾乎與標本片相接觸。然后眼睛從目鏡觀測（如光線局限性,可適當增大電源電壓）,漸漸上旋粗調(diào)節(jié)器至看到模糊物像之后，再用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)以使物像清楚。如鏡頭已離開油面尚未看到物像,則再重新操作。更換標本時應(yīng)先提高油鏡頭，再更換玻片，切勿隨意移動顯微鏡的位置。油鏡觀測完畢后，按“顯微鏡保護”中（6）項解決。最后將油鏡各部分還原,聚光器下降,反光鏡垂直于鏡座,鏡頭轉(zhuǎn)成八字形，以免與聚光器發(fā)生碰撞。四、思考題1、使用顯微鏡時為什么調(diào)節(jié)下列構(gòu)造?反光鏡,光圈，聚光器，粗調(diào)節(jié)器,細調(diào)節(jié)器,鏡頭回轉(zhuǎn)器。答:聚光器的位置之升降可影響視野的明亮度，上升則視野明亮，下降則光線減弱。光圈的放大或縮小也可控制視野明亮限度。粗調(diào)節(jié)器和細調(diào)節(jié)器均是調(diào)節(jié)焦距的裝置。鏡頭回轉(zhuǎn)器為裝置物鏡和轉(zhuǎn)換物鏡之用。2、使用不同放大倍數(shù)的物鏡時，工作距離與光圈的關(guān)系。如何運用這一原理用好顯微鏡?答:物鏡的放大倍數(shù)愈大，其工作距離(物鏡鏡頭到標本片之間的距離）愈短。標本一方面經(jīng)物鏡放大,在目鏡的焦距平面上形成一個實像,再通過目鏡放大成最終的虛像?？偟姆糯蟊稊?shù)是物鏡放大倍數(shù)與目鏡放大倍數(shù)的乘積。３、為什么要選用與玻璃折射率相似的香柏油作為油鏡的介質(zhì)?油鏡的原理是什么？答：HYPEＲLIＮK"＂＼ｔ"＿blaｎk＂香柏油只在使用油鏡頭時(100倍ＨYPERLINK""\ｔ"＿blａnk"物鏡）使用，由于當鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時,由于空氣(ｎ＝1.52）的HYPEＲＬＩＮK""\ｔ＂＿blａｎｋ"折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進入ＨYＰERＬINK＂"\t＂＿blanｋ"物鏡的光線減少,減少了視野的HＹPERLＩNＫ""\ｔ＂_blaｎk＂照明度,并且會減少鏡口角。當以HYPERＬINK＂＂＼t"＿blａnk"香柏油（n＝1.５１5)為介質(zhì)時,由于它的HYＰＥRＬINK＂"\t＂_blａnk"折射率與ＨYPERLIＮK"＂\t"_blaｎk＂玻璃相近,光線通過HＹPERＬINK""＼t"_ｂlaｎｋ"載玻片后可直接通過HＹPERLINK""\t"_ｂlank"香柏油進入HYPＥＲＬINK""＼t"_bｌanｋ＂物鏡而不發(fā)生折射,不僅增長了視野的HYPERLINK＂＂\t"_bｌank"照明度,更重要的是通過增長ＨYＰERLINＫ""\t＂_ｂｌaｎk"數(shù)值孔徑達成提高分辨率的目的。HYＰＥＲLIＮK＂"\t"_blａnk"可見光的波HYＰERＬIＮＫ""＼t＂_blａnｋ＂長平均為0.55μm。當使用HＹPERLINK＂"＼ｔ＂＿bｌaｎk＂數(shù)值孔徑為0．６５的高倍鏡時,它能辨別兩點之間的距離為０.42μm；而使用ＨYPERLINK"＂\t"_blanｋ＂數(shù)值孔徑為１.25的油鏡時,能辨別兩點之間的距離則為0.22μｍ。選用香HYＰＥＲＬINK"＂\ｔ"_blaｎｋ"柏油是由于它的HＹＰＥRLINK""\ｔ"＿blank"折射率是1.５１54、顯微鏡有哪幾種?各自的重要特性是什么?答：光學(xué)顯微鏡中除明視野顯微鏡外,尚有暗視野顯微鏡、相差顯微鏡和熒光顯微鏡；除光學(xué)顯微鏡外,尚有電子顯微鏡。暗視野顯微鏡:在普通光學(xué)顯微鏡載物臺下安裝一個暗視野聚光器即成暗視野顯微鏡。相差顯微鏡:相差顯微鏡成像的原理和普通光學(xué)顯微鏡同樣,所不同的是相差顯微鏡涉及有環(huán)狀光闌、裝有相板的相差物鏡和全軸調(diào)整望遠鏡三個特殊部分。熒光顯微鏡:熒光顯微鏡的重要特性是以紫外線為光源，當照射到用熒光素標記的細菌時，熒光素吸取了紫外線的能量后,再發(fā)射出可見的橙、黃、淺綠色熒光。由于用熒光素標記的菌體各種結(jié)構(gòu)中的溶解、吸附或化合情況不一，于是發(fā)出不同色調(diào)和亮度的熒光,從而可以觀測細菌的不同結(jié)構(gòu)。電子顯微鏡:電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和工作原理與普通光學(xué)顯微鏡非常相似，不同的是用電子流代替光線,用電磁圈代替透鏡聚焦。第二部分:細菌形態(tài)學(xué)檢查方法一、目的規(guī)定了解不染色標本檢查法,用懸滴法觀測活細菌及其動力。熟悉染色標本的制備過程，掌握革蘭氏染色法及其結(jié)果判斷，了解革蘭氏染色法原理。了解其它常用染色法。二、實驗原理檢查細菌形態(tài)的重要工具是顯微鏡,可根據(jù)不同目的將細菌染色或不染色進行鏡檢。常用的堿性染料有結(jié)晶紫、美藍、堿性復(fù)紅等。染色法又分單染色法和復(fù)染色法兩大類。單染色法即僅用一種染料著色，所有的細菌均被染成一種顏色，無鑒別細菌的作用。復(fù)染色法又稱鑒別染色法,通常用二種或二種以上的染料著色,由于不同種類的細菌或同種細菌的不同組成結(jié)構(gòu)對染料有不同的反映性而被染成不同的顏色，從而有鑒別細菌的作用。最常用的細菌復(fù)染色法是革蘭氏染色法（Graｍsｔａｉｎ）。通過革蘭氏染色法操作,可把細菌提成兩大類：革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。凡能使第一種染料結(jié)晶紫保存藍色的細菌叫革蘭氏陽性細菌,凡被灑精脫色后染上對比顏料沙黃或稀釋復(fù)紅而呈紅色的細菌叫做革蘭氏陰性細菌。三、實驗內(nèi)容（一）染色標本的制備及觀測1、復(fù)染色法(革蘭氏染色法）材料：葡萄球菌瓊脂培養(yǎng)物１支大腸桿菌瓊脂培養(yǎng)物1支革蘭氏染液一套：結(jié)晶紫、９5%酒精、路哥氏碘液、稀釋復(fù)紅各1瓶。玻片，接種環(huán)，酒精燈，吸水紙等。方法：（１)涂片用葡萄球菌和大腸桿菌混合涂片。①取玻片一塊，拭凈。②用無菌接種環(huán)取生理鹽水一滴，放在玻片中央(如被檢材料是液體，可不加生理鹽水)。③左手斜持菌種試管,右手將菌種試管棉塞稍加轉(zhuǎn)動，以便拔下。④右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌后,用右手小拇指拔開菌種試管棉塞，試管口通過火焰，將接種環(huán)插入試管中取菌少許(切不可多,更不可將培養(yǎng)基刮下）。⑤試管口再通過火焰,塞好棉塞。⑥將接種環(huán)上的細菌加入玻片上之水滴內(nèi)，磨勻，涂成直徑為1cm大小的薄菌膜。⑦接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌。．（2）干燥涂片置于空氣中,使其自然干燥。(3）固定干燥后將涂片在火焰上緩緩?fù)ㄟ^三次,此為“固定”。目的是使細菌粘于玻片上,染色和水沖時不易脫落；且細菌為蛋白質(zhì),被熱凝固可保持完整形態(tài)。(４）染色初染→媒染→脫色→復(fù)染①加結(jié)晶紫染液于標本上,使其覆滿標本,染1~2分鐘。②細水沖洗。③加路哥氏碘溶液經(jīng)1分鐘。④水洗。⑤加95%酒精于玻片上來回流動，傾去酒精。如此反復(fù)2～3次（約30秒鐘）。⑥水洗。⑦加稀釋復(fù)紅染液，染約1分鐘。⑧水洗,用吸水紙吸干。（5）鏡檢革蘭氏陽性菌在結(jié)晶紫著色后不易被酒精脫色,故仍為深藍色或紫色；革蘭氏陰性菌在結(jié)晶紫著色后易被酒精脫色,故經(jīng)稀釋復(fù)紅復(fù)染后成紅色。三、實驗記錄革蘭氏染色過程:取玻片一塊,在玻片上滴三小滴水(有一定的距離），分別用接種環(huán)取EＣ（大腸桿菌）和BS(金黃色葡萄球菌)與兩邊的水滴上，并混勻,灼燒接種環(huán)后再分別取EＣ和BS于中間的水滴上混勻（即中間水滴是兩種菌的混合物），并在酒精燈下灼燒至干（小心不要將玻片炸裂)，用結(jié)晶紫進行初染,細水沖洗后，加路哥氏碘液進行媒染,水洗后加酒精脫色2~３次,水沖洗后加稀釋復(fù)紅染液復(fù)染一分鐘,水洗,并用吸水紙吸干。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,染色后呈紫紅色。普葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,染色后呈現(xiàn)藍紫色。以下為實驗觀測圖：四、思考題1．染色法在微生物學(xué)上有何實際意義?染色法可以更方便的觀測細菌的具體形態(tài),更方便觀測細菌，革蘭氏染色法有更重要的意義，可以鑒別細菌，把眾多的細菌分為兩大類，HYＰEＲLIＮK""\t＂_ｂｌaｎk"革蘭氏陽性菌和ＨYPEＲLＩNK""\t＂_ｂlａnk"革蘭氏陰性菌，在實驗方面,可以通過殺死陽性或陰性菌而得到目的菌。2.比較復(fù)染色法與單染色法的優(yōu)缺陷。答：單染色法：優(yōu)點:僅用一種染料著色，所有的細菌均被染成一種顏色，簡樸方便，可用來觀測細菌的形態(tài)和排列方式。缺陷：但無鑒別細菌的作用。復(fù)染色法:優(yōu)點:用二種或二種以上的染料著色，由于不同種類的細菌或同種細菌的不同組成結(jié)構(gòu)對染料有不同的反映性而被染成不同的顏色，從而有鑒別細菌的作用。缺陷：使用試劑較多,過程較單染色法更復(fù)雜繁瑣。3．以革蘭氏染色法為例,說明它至少要涉及幾種試劑？各起何作用？答：至少用到4種試劑。結(jié)晶紫溶液進行初染，路哥氏碘液進行媒染,９5%酒精進行脫色，稀釋復(fù)紅染液進行復(fù)染。4．要確證一個未知細菌的革蘭氏染色性質(zhì),你可用什么方法來說明你的結(jié)果是可靠的?答：通過在顯微鏡下的菌體被染的顏色可以判斷,凡能使第一種染料結(jié)晶紫保存藍色的細菌為革蘭氏陽性細菌，凡被灑精脫色后染上對比顏料沙黃或稀釋復(fù)紅而呈紅色的細菌為革蘭氏陰性細菌。微生物學(xué)實驗報告實驗二培養(yǎng)基的的制備滅菌及接種技術(shù)培養(yǎng)基的制備和滅菌一、目的規(guī)定掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)具有的條件及其制備方法。二、實驗原理培養(yǎng)基是人工配制的供應(yīng)細菌或其它微生物生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。微生物的種類雖然繁多，但對基本營養(yǎng)物質(zhì)如碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水分等的規(guī)定卻有共同性。這些營養(yǎng)物質(zhì)的作用是:提供合成菌體和代謝產(chǎn)物的原料;提供生命活動必需的能量；調(diào)節(jié)代謝環(huán)境。作為培養(yǎng)基必須具有下列條件:①具有適當?shù)乃趾鸵欢ㄅ浔鹊倪m宜的營養(yǎng)物質(zhì)。②具有合適的酸堿度（pＨ值)。③有適當?shù)奈锢頎顟B(tài):液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。④培養(yǎng)基必須經(jīng)滅菌成為無菌狀態(tài)后方能使用。運用培養(yǎng)基對細菌等進行人工培養(yǎng)，在微生物學(xué)上有重要意義。例如,細菌純培養(yǎng)物的分離、培養(yǎng),細菌生物學(xué)特性的研究、分類鑒定，菌種保藏等都需要運用培養(yǎng)基進行人工培養(yǎng)。同時在傳染病的診斷、生物制品的研制、發(fā)酵生產(chǎn),以及運用細菌等作為工具進行的其它學(xué)科的研究中(如遺傳學(xué)、基因工程等)，都離不開培養(yǎng)基的應(yīng)用和細菌的人工培養(yǎng)?；A(chǔ)培養(yǎng)基一般指的是營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，它通常由蛋白胨（重要作為氮源）、牛肉浸膏（作為碳源、氮源、維生素和無機鹽）、氯化鈉(無機鹽并具有維持一定的滲透壓的作用）和水所組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基具有大多數(shù)細菌生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。此外,根據(jù)培養(yǎng)基的組成和使用目的菌不同，尚有加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基等。三、實驗內(nèi)容（一）馬丁培養(yǎng)基的配制：葡萄糖10．0ｇ、蛋白胨５．0g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.0g、硫酸鎂(ＭgSO4·７H2O)0．5g、孟加拉紅33.4mg、蒸餾水1000ｍＬ、實驗中使用的是已經(jīng)配制好的培養(yǎng)基粉,稱取36ｇ,加入1000ml水,分裝在兩個5０0ｍl的錐形瓶中，包扎，置于高溫滅菌鍋中121℃下滅菌30mｉｎ。滅菌后進行倒平板備用。四、思考題１．液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基各有何功用?答：HYＰERLIＮK"＂＼t"_blanｋ"液體培養(yǎng)基：組分均一,適宜各類HYPＥRLINＫ""\ｔ＂＿blaｎk"微生物的HYPERLIＮK""＼t"_ｂｌanｋ＂營養(yǎng)生長。廣泛應(yīng)用于實驗研究及大規(guī)模HYPERLINＫ"＂\t"_ｂlanｋ"工業(yè)生產(chǎn)中，有助于廣泛獲得大量菌體或代謝產(chǎn)物。HYPＥRＬＩＮK"＂＼t＂＿blank＂固體培養(yǎng)基：HYＰEＲＬＩＮK""\ｔ"_bｌanｋ"瓊脂HＹPＥRLINK""\t"＿blａnk"固體培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于HYPＥRLＩNＫ"＂\t＂_ｂlaｎk"微生物的分離培養(yǎng)、ＨＹPERLＩNK""＼t"＿blanｋ"菌種鑒定和保藏。HＹPERLINK""半固體培養(yǎng)基:用于HYPＥＲLINK＂"＼ｔ"_blaｎk"觀測細菌的運動、HＹPERLINK"＂\ｔ"_ｂｌaｎk"菌種鑒定及測定ＨYPEＲＬＩNK"＂\t＂_blank"噬菌體的HYPERLINＫ""\ｔ＂_blank＂效價等。2．細菌的人工培養(yǎng)需要哪些條件，在微生物學(xué)上有何重要意義?答：需要基本營養(yǎng)物質(zhì)：如碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水分等。細菌純培養(yǎng)物的分離、培養(yǎng),細菌生物學(xué)特性的研究、分類鑒定,菌種保藏等都需要運用培養(yǎng)基進行人工培養(yǎng)。同時在傳染病的診斷、生物制品的研制、發(fā)酵生產(chǎn),以及運用細菌等作為工具進行的其它學(xué)科的研究中（如遺傳學(xué)、基因工程等）,都離不開培養(yǎng)基的應(yīng)用和細菌的人工培養(yǎng)。微生物學(xué)實驗報告實驗三自然界中微生物的分離與純化一、目的規(guī)定1、學(xué)習(xí)并掌握從自然界中分離微生物的方法。２、掌握細菌、放線菌、酵母菌、霉菌的分離純化方法；二、基本原理土壤是微生物生活的大本營,是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的重要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細菌數(shù)量最多；另一方面為放線菌和霉菌。一般在較干燥、偏堿性、有機質(zhì)豐富的土壤中放線菌數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實驗從土壤中分離細菌、放線菌和霉菌；自面肥或酒曲或果園土分離酵母菌。從混雜的微生物群體中獲得只具有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的是平板分離法和劃線分離法，純化該微生物，直至得到純菌株。平板分離法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋，使其中的微生物充足分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上,通過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落,即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。該法雖然操作繁瑣，但可獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢查（如活菌制劑）,以及食品、飲料和水等的含菌指數(shù)或污染限度的檢測。三、實驗材料（一)菌源1、土樣：選定采土地點后,鏟去表土層２～3ｃm，取３~10cｍ深層土壤1０g，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，并記錄取樣地點、環(huán)境及日期。土樣采集后應(yīng)及時分離，凡不能立即分離的樣品,應(yīng)保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌相的變化。（二）培養(yǎng)基（制平板）1、馬丁培養(yǎng)基:葡萄糖１０.0ｇ、蛋白胨5.0g、磷酸二氫鉀（KH2PO4)1.0g硫酸鎂(ＭgSO4·7H2O)0.5ｇ、孟加拉紅33.4ｍg、蒸餾水1０0０mL、121℃３０min滅菌。(三）無菌水配制無菌水，分裝于2５0mL錐形瓶，每瓶裝99mL)，每瓶內(nèi)裝4~4粒玻璃珠。分裝試管、每管裝9mL(每組4支），1２1℃滅菌2０miｎ。(四)其他物品:無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒、稱量紙、藥勺、橡皮頭、10%酚溶液。四、操作環(huán)節(jié)(一）稀釋涂布平板分離法（1)制備土壤稀釋液稱取土樣10g，放入到盛有９9mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩10~20min，使土壤均勻分散成土壤懸液(10－１）。用1mL的無菌移液管從中吸取1mL土壤懸液，移入到分裝有9mＬ無菌水的試管中，吸吹3次,振蕩均勻(1０-2)。用同樣方法依次制成１0－2~10－4的土壤稀釋液(為避免稀釋過程誤差，進行微生物計數(shù)時，最佳每一個稀釋度更換一支移液管)。（2)涂布法分離依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化的培養(yǎng)基,待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取上述10－１、１0-2、１0-3、10-４四個稀釋度菌懸液0．２ｍＬ，依次滴加于相應(yīng)編號已制備好的培養(yǎng)基平板