一種新的乙肝診斷血清免疫學(xué)指標(biāo)－乙肝病毒大蛋白課件

一種新的乙肝診斷血清免疫學(xué)指標(biāo)

－－－－乙肝病毒大蛋白

乙型肝炎流行現(xiàn)狀乙型肝炎是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。全球60億人口中，約1/2人口生活在HBV高流行區(qū)，約20億人證明有HBV感染，3～4億人為HBV慢性感染，其中25%～40%最終將死于肝硬化和肝癌。全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡約75萬例中國乙型肝炎流行現(xiàn)狀(一)HBeAg陰性活動期肝炎增多(二)HBV變異株增加HBV的突變率較高，

HBeAg陰性活動期肝炎HBeAg陰性乙肝與HBeAg陽性乙肝不同點(diǎn)：(1)慢性肝炎病情不減輕；(2)生化學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志反復(fù)升高；(3)可30～40年無癥狀；(4)約45歲左右發(fā)生肝硬化；(5)10年后約25%發(fā)生并發(fā)癥。HBeAg陰性活動期肝炎HBeAg陰性的慢性乙肝流行率升高原因：(1)持續(xù)免疫壓力導(dǎo)致突變株選擇；(2)長期治療導(dǎo)致病毒變異；(3)前C和C啟動子變異；(4)檢測方法的靈敏度提高。

HBeAg陰性活動期肝炎HBeAg陰性活動期肝炎臨床診斷現(xiàn)狀：(1)傳統(tǒng)“兩對半”指標(biāo)不能反映此類患者HBV復(fù)制程度；(2)缺乏指導(dǎo)合理治療的指標(biāo)；(3)HBVDNA檢測不易于各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開展；(4)臨床上急需能夠反映HBV復(fù)制程度及指導(dǎo)治療的指標(biāo)。

抗病毒治療效果監(jiān)測臨床上缺乏評估抗病毒治療效果的指標(biāo)。以HBVDNA陰轉(zhuǎn)作為治療的終點(diǎn)不恰當(dāng)，此時(shí)停藥病情易反復(fù)。乙肝病毒實(shí)驗(yàn)室檢測的缺陷

抗病毒治療效果評價(jià)血清學(xué)指標(biāo)缺乏

臨床上評價(jià)抗乙肝病毒治療效果時(shí)存在一個(gè)很大的問題，即其評價(jià)指標(biāo)主要是肝功能的改善與否、血清乙肝病毒DNA水平的變化以及肝組織的病理學(xué)改變等。誠然，這些指標(biāo)對臨床醫(yī)生判斷患者病情而言非常重要和實(shí)用，也是臨床醫(yī)生選用抗乙肝病毒藥物時(shí)的依據(jù)，然而對于何時(shí)停用抗病毒藥物、停用抗病毒藥物后乙肝病毒是否會重新復(fù)制活躍導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)則缺乏客觀而有效的指標(biāo)。

乙型肝炎血清學(xué)診斷技術(shù)新突破

乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）前S區(qū)酶免定量試劑盒

-------直接定量檢測乙肝大蛋白-------不用分開檢測前S1和前S2乙肝病毒包膜蛋白研究進(jìn)展1995-2004年發(fā)現(xiàn)大蛋白前S區(qū)有復(fù)雜構(gòu)象結(jié)構(gòu)1996年發(fā)現(xiàn)大蛋白具有反式激活病毒復(fù)制的作用2002年發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肝細(xì)胞病變及凋亡的主要原因是大蛋白2004年實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建針對構(gòu)象型抗原的單克隆抗體2005年國內(nèi)公司成功研制乙肝表面抗原大蛋白酶聯(lián)免疫定量試劑盒HepatitisB——乙型肝炎HBV模型HBV的表面抗原的組成HBV病毒結(jié)構(gòu)成分HBV-LP與病毒復(fù)制密切相關(guān)HBVDane管形球型血流中的分布L-HBs大蛋白存在存在不含僅病毒復(fù)制期存在M-HBs中蛋白存在存在1%含量非復(fù)制期少量存在S-HBs小蛋白存在存在存在存在根據(jù)檢測血液中大蛋白的有無，判斷病毒攜帶者體內(nèi)的HBV病毒是否在進(jìn)行復(fù)制。PrangeR,StreeckRE.NoveltransmembranetopologyofthehepatitisBvirusenvelopeproteins.EMBOJ1995;14:247-256LambertC.etal.Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnaviral

lareenvelopeproteinsJ.GeneralVirology200485,1221-1225.乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究HBV病毒顆粒表面的PreS已經(jīng)被證實(shí)具有獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域和天然構(gòu)象很多研究致力于表達(dá)并觀測PreS的結(jié)構(gòu)，但是極少成功。其原因是單獨(dú)表達(dá)的PreS很容易被蛋白酶所降解。(A)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。(B)病毒體包膜上的乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。VolkerBruss,XuanyongLu1,ReinerThomssenandWolframH.Gerlich'.Post-translationalalterationsintransmembranetopologyofthehepatitisBviruslargeenvelopeprotein.TheEMBOJournalvol.13no.10pp.2273-2279,1994乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究HBVL包膜蛋白（大蛋白）的結(jié)構(gòu)域和穿膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

A.大蛋白的構(gòu)成組分，含preS1、preS2及S結(jié)構(gòu)

B.大蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)CarstenLambert,SylviaMannandReinhild

Prange.Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallargeenvelopeproteins.JournalofGeneralVirology(2004),85,1221–1225乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究L蛋白i-pre-S形式的功能模式圖。黑點(diǎn)表示L蛋白pre-S結(jié)構(gòu)略去S和M蛋白分泌的病毒體表面的e-pre-S結(jié)構(gòu)很可能具有結(jié)合病毒受體的功能。目前的數(shù)據(jù)顯示L蛋白的i-pre-S結(jié)構(gòu)是一種蛋白矩陣，在病毒體的形成過程中負(fù)責(zé)與核殼體相接觸，包裝外膜。VOLKERBRUSS*ANDKERSTINVIELUF.FunctionsoftheInternalPre-SDomainoftheLargeSurfaceProteininHepatitisBVirusParticleMorphogenesis.JOURNALOFVIROLOGY,Nov.1995,p.6652–6657Vol.69,No.11肝炎病毒物種特異性的感染取決于病毒進(jìn)入的水平，并由病毒L蛋白上的pre-S結(jié)構(gòu)決定。

Arg103和Ser124之間的序列在不同的HBV之間是高度保守的。Arg103和Ser124之間的pre-S序列對于HBV的形成具有重要功能。ＡＡ１０３－１２４橫跨前Ｓ１和前Ｓ２之間乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究VOLKERBRUSS.AShortLinearSequenceinthePre-SDomainoftheLargeHepatitisBVirusEnvelopeProteinRequiredforVirionFormation.JOURNALOFVIROLOGY,Dec.1997,p.9350–9357Vol.71,No.12TAKASHIISHIKAWAANDDONGANEM.Thepre-SdomainofthelargeviralenvelopeproteindetermineshostrangeinavianhepatitisBviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.92,pp.6259-6263,July1995

BrunsM,MiskaS,ChassotS,WillH.EnhancementofhepatitisBVirusinfectionbynoninfections

subviralparticles.JVirol,1998;76;1462-8.乙肝鴨模型證實(shí)由大蛋白組裝成的亞病毒顆粒能夠反式激活病毒繼續(xù)復(fù)制這個(gè)研究具有臨床意義,對于大蛋白陽性而DNA陰性患者容易停藥反跳具有參考意義.亞病毒顆粒上pre-S的反式激活作用原文：UltrastructuralAnalysisofHepatitisBVirusinHepG2-TransfectedCellsWithSpecialEmphasisonSubviralFilamentMorphogenesis作者：PHILIPPEROINGEARDANDCAMILLESUREAU作者單位：LaboratoiredeBiologieCellulaire,EPCNRS117,Faculte′deMe′decinedeTours,2bisBoulevardTonnelle′,F-37032ToursCedexFrance.發(fā)表刊物：HEPATOLOGYVol.28,No.4,1998

在乙肝病毒感染的HepG2細(xì)胞中對亞病毒纖維體的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析大蛋白與肝細(xì)胞病變研究大蛋白的過量表達(dá),管狀顆粒在細(xì)胞內(nèi)堆積,導(dǎo)致體外培養(yǎng)的細(xì)胞5天內(nèi)死亡Chisari等和Fernandes等已經(jīng)證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中過量表達(dá)大的表面蛋白會使肝細(xì)胞凋亡并且產(chǎn)生慢性肝炎。然而，在他們模型中的這種損傷相對比較溫和，沒有小鼠死于肝功能衰竭.轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞帶有這種蛋白L的積累滯留，則會發(fā)展為細(xì)胞的損傷作用，它會誘導(dǎo)肝的再生，在這個(gè)模型中最終導(dǎo)致肝癌大蛋白導(dǎo)致肝細(xì)胞病變研究大蛋白是導(dǎo)致FCH中肝細(xì)胞損傷,纖維化的主要原因FCH與肝細(xì)胞內(nèi)大蛋白過量表達(dá)蛋白L的滯留也被發(fā)現(xiàn)和一種獨(dú)特的綜合癥，即纖維淤膽性肝炎（FCH）相聯(lián)系，它的特征為肝細(xì)胞的空氣球化和有著顯著的膽汁阻塞，但是它一般只有很少的炎癥發(fā)生，它發(fā)生于免疫抑制的乙肝攜帶者。來自于發(fā)生了FCH的病人的肝臟樣品，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中有著同樣的乙肝亞病毒包膜纖維體的積累。2002年國際肝病雜志實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)的乙肝大表面蛋白致使培養(yǎng)的肝細(xì)胞在一些天內(nèi)死亡。乙肝大的表面蛋白會致使體外培養(yǎng)的細(xì)胞的液泡化和細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果和FCH下的肝臟病理情況相當(dāng)?shù)叵嗨疲瑖鴥?nèi)pre-S研究（部分）文獻(xiàn)一：EstablishmentandprelimineryuseofhepatitisBVirusPreS1/2antigenassay

WorldJourneryofGastroenterology99年軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院３所文獻(xiàn)二ＥxpressionandpurificationofthecompletepreSregionofhepatitisBVirusWorldJournalofGastroenterology2005年中科院上海生化和細(xì)胞所抗原表位目前生物科學(xué)領(lǐng)域，對天然表位的研究借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對表位已經(jīng)有比較深刻的認(rèn)識。表位的構(gòu)成方式至少有兩種：①由某些氨基酸殘基按一定順序連續(xù)排列組成的線狀序列，稱為順序（sequential）表位或線性(linear)表位。順序表位是蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)，比較穩(wěn)定，不受蛋白質(zhì)加熱變性和空間構(gòu)形改變的影響。②由分子內(nèi)不連續(xù)的2～3個(gè)氨基酸殘基折疊排列所形成的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)成，稱為構(gòu)象(conformational)表位；有時(shí)候，呈α螺旋式排列的連續(xù)肽鏈序列也可起到構(gòu)象表位的作用。多肽無法模擬構(gòu)象表位商品化的前S1定性檢測試劑上市，其單抗是用AA21-47化學(xué)合成的多肽而制作的。而應(yīng)用該多肽免疫制作的抗體在科研中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，只能檢測到微弱的抗-pre-S1抗體的產(chǎn)生多肽無法模擬構(gòu)象表位Schodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多肽免疫Balb/c小鼠，誘導(dǎo)生成的抗pre-s1抗體的滴度只有160，上海生化所改進(jìn)應(yīng)用pre-S1-BSA偶聯(lián)復(fù)合物免疫Balb/c小鼠，也只能檢測到微弱的抗Pre-S1的活力，

目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑大部分研究主要集中在前S1區(qū)、前S2區(qū)。研究表明前S1區(qū)、前S2區(qū)蛋白及其抗體都與HBV-DNA、HBeAg、肝臟損害、乙肝的轉(zhuǎn)歸等都有極其密切的關(guān)系。臨床應(yīng)用：前S1試劑、前S2試劑診斷的結(jié)果與HBV-DNA、HBeAg

三者之間有一定的關(guān)系，但符合率卻只有６0－８０%，甚至更低。楊海林等完整病毒顆粒Dane顆粒標(biāo)志物PreS1蛋白藥盒的研制上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志1995vol.10:204-206楊海林等抗乙肝炎病毒表面抗原PreS1（20－47）多肽的制備、性質(zhì)和應(yīng)用。生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1994vol26145-151使用針對化學(xué)合成多肽的單克隆抗體，無法定量監(jiān)測，無法用于療效觀察臨床應(yīng)用４－５年，靈敏度不理想，目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑乙肝大蛋白定量診斷試劑應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白晶體學(xué)的研究，研發(fā)出針對乙肝病毒前S區(qū)的構(gòu)象型單抗，大大提高了乙肝病毒感染者中前S區(qū)抗原即LP大蛋白的檢出率，臨床應(yīng)用表明大蛋白的檢出率與血液中病毒DNA的符合率高度符合（＞90%）。比原來的前S1試劑效果大大提高，可作為病毒復(fù)制的一個(gè)指標(biāo)。乙肝大蛋白Ｐre-S抗原蛋白晶體結(jié)構(gòu)HBV-lp晶體結(jié)構(gòu)—空間模型針對大蛋白構(gòu)象表位單抗研制簡要過程

（本方法是我們已經(jīng)申請的專利的一部分）獲得體外重組的PRE-S抗原獲得多抗，親和層析從強(qiáng)陽性標(biāo)本中獲得病毒樣顆粒病毒樣顆粒制作抗體大蛋白試劑臨床研究1、HBVDNA陽性標(biāo)本中HBV－LP的陽性符合率考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）例（次）數(shù)例（次）數(shù)比例（％）北京地壇醫(yī)院126825494.78北京地壇醫(yī)院2（治療系列）115214998.03解放軍傳染病研究所17013579.41遼寧沈陽傳染病醫(yī)院14313493.71浙江省湖州中心醫(yī)院（治療系列）213312896.24合計(jì)84878392.33注：1阿德福韋抗病毒治療患者43例，共檢出HBVDNA陽性152次；2拉米夫定抗病毒治療患者51例，共檢出HBVDNA陽性133次。2、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽性率以及OD值比較大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDNA拷貝數(shù)例數(shù)陽性例數(shù)陽性率（％）大蛋白OD1＜104(陰性)842321.380.266±0.0442104432967.440.416±0.0813105634673.020.504±0.2054106242187.500.898±0.1805107171694.121.275±0.31961082323100.001.428±0.238注：解放軍傳染病研究所，HBVDNA拷貝數(shù)對數(shù)值與HBV－LPOD值的相關(guān)系數(shù)r=0.945大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDNA拷貝數(shù)例(次)數(shù)陽性例(次)數(shù)陽性率（％）陽性含量均值（ng）1103544888.8917.602104383797.3724.693105585696.5530.444106656396.9255.465＞106808010086.61合計(jì)/29528195.25/注：北京地壇醫(yī)院與沈陽傳染病醫(yī)院匯總，其中北京地壇醫(yī)院為阿德福韋抗病毒治療患者標(biāo)本。HBVDNA拷貝數(shù)對數(shù)值與HBV－LP含量（ng）的相關(guān)系數(shù)3、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽性率以及含量比較r=0.935大蛋白試劑臨床研究4、HBV－LP試劑與乙肝前S1試劑比較大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）乙肝前S1（＋）例數(shù)例數(shù)比例（％）例數(shù)比例（％）北京地壇醫(yī)院26825494.7817665.67解放軍傳染病研究所17013579.419757.06合計(jì)43838988.8127362.33大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）HBeAg（＋）北京地壇醫(yī)院沈陽傳染病醫(yī)院例數(shù)例數(shù)比例（％）例數(shù)比例（％）39136894.1217745.275、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中的比較5、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中的比較大蛋白試劑臨床研究HBVDNA（＋）HBeAg(＋)HBeAg(—)合計(jì)177#214*391HBV－LP（＋）172（97.18%）196（91.59%）368（94.12%）注：#其中北京地壇醫(yī)院109份；沈陽傳染病醫(yī)院68份*其中北京地壇醫(yī)院159份；沈陽傳染病醫(yī)院55份6、不同HBV模式的患者中HBV－LP與HBVDNA的比較大蛋白試劑臨床研究HBVM

模式例數(shù)HBVDNA（＋）例數(shù)陽性率(%)HBV－LP（＋）例數(shù)陽性率(%)HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)21820292.6720694.50HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)20716780.6815876.33HBsAg(+)HBeAg(+)231982.611878.26HBsAg(+)HBcAb(+)371335.141643.24合計(jì)48540182.6839882.06大蛋白試劑臨床研究7、HBV－LP試劑盒抗干擾能力的考評考核單位干擾血清HBV－LP結(jié)果所患疾病例數(shù)陽性例數(shù)陽性率（％）北京地壇醫(yī)院甲肝800丙肝800戊肝800兩種肝炎混合感染*600沈陽傳染病醫(yī)院丙肝2000合計(jì)/5000注：*含甲肝乙肝混合感染、丙肝乙肝混合感染以及戊肝乙肝混合感染各2份8、HBV－LP試劑盒的特異性考評大蛋白試劑臨床研究考核單位考評標(biāo)本HBV－LP結(jié)果標(biāo)本來源例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)特異性（％）河北省血液中心正常獻(xiàn)血員21183211599.86解放軍傳染病研究所體檢健康者1000100100北京地壇醫(yī)院體檢健康者57057100合計(jì)/22753227299.87大蛋白試劑臨床研究9、HBV－LP用于抗病毒治療的監(jiān)測北京地壇醫(yī)院進(jìn)行了阿德福韋治療患者的過程監(jiān)測浙江湖州中心醫(yī)院進(jìn)行了拉米夫定治療患者的過程監(jiān)測北京大學(xué)生物系進(jìn)行了干擾素治療患者的過程監(jiān)測北京地壇醫(yī)院阿德福韋治療監(jiān)測地壇阿德福韋治療系列血清典型病例典型分析藥物治療無效病例治療現(xiàn)有效果后反跳治療先有效后反跳治療先有效后反跳治療先有效后反跳浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測抗病毒治療過程中HBVDNA陰轉(zhuǎn)不能做為治療終點(diǎn)的指標(biāo)，HBVDNA陰轉(zhuǎn)之后患者的病情會出現(xiàn)反