枯草芽孢桿菌嘌呤合成路徑的優(yōu)化對腺苷積累的作用,生物技術(shù)論文

枯草芽孢桿菌嘌呤合成路徑的優(yōu)化對腺苷積累的作用,生物技術(shù)論文腺苷(Adenosine)化學(xué)名為6-氨基-9--D-呋喃核糖基-9-氫嘌呤，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。早在20世紀(jì)50年代，應(yīng)用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的研究就已經(jīng)開場，但是對腺苷研究的報道主要集中在菌種的選育和培養(yǎng)基的優(yōu)化，使用基因工程技術(shù)改造腺苷生產(chǎn)菌的研究卻很少。本實驗室保藏的腺苷生產(chǎn)菌BacillussubtilisXGL，是通過長期誘變挑選而成，但是進(jìn)一步誘變對產(chǎn)苷影響不大，要獲得愈加優(yōu)良的菌株，需要利用新的方式方法對其進(jìn)一步改造。前期研究顯示，對嘌呤合成途徑改造，改變途徑中關(guān)鍵酶的活性進(jìn)而影響嘌呤合成速率，能夠有效地提高肌苷、核黃素的產(chǎn)量。因而，嘌呤合成途徑的強(qiáng)弱直接影響核苷類物質(zhì)的合成。嘌呤合成途徑的重要中間代謝物肌苷酸(IMP)是腺苷合成的直接前體物，肌苷酸的供給很可能是工程菌中腺苷合成通量的主要限制因素之一。因而，增加葡萄糖到IMP的合成途徑通量能夠提高腺苷合成中前體物的供給，繼而促進(jìn)腺苷的積累。在枯草芽孢桿菌中，嘌呤核苷酸合成相關(guān)的基因組成嘌呤操縱子，嘌呤操縱子(purEKB-purC(ORF)QLF-purMNH(J)-purD)全長13339bp，由于嘌呤操縱子整體較大，而嘌呤合成途徑中關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶編碼基因purF位于嘌呤操縱子的中下游，距離啟動子較遠(yuǎn)，轉(zhuǎn)錄效率不高。因而本研究以B．subtilisXGL為出發(fā)菌株，以溫敏質(zhì)粒pKS1為骨架，構(gòu)建整合質(zhì)粒pKF，利用單交換的方式將強(qiáng)啟動子P43插入至嘌呤操縱子中，不僅過表示出了嘌呤合成途徑中關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶編碼基因purF，而且其下游基因purM、purN、purH和purD表示出水平也得到不同程度的提高。這些相關(guān)基因的共同表示出將比單一加強(qiáng)表示出purF基因催化更多的嘌呤前體物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氫葉酸進(jìn)入嘌呤途徑，將愈加有效地提高嘌呤合成途徑通量。1、材料和方式方法1.1材料1.1.1菌株和質(zhì)粒:表1為本研究所用菌株和質(zhì)粒。1.1.2引物:表2為本研究使用的引物，均由PrimerPremier5.0軟件設(shè)計。1.1.3培養(yǎng)基:①種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母粉5，味精5，蛋白胨8，尿素5，黃嘌呤0.03，L-組氨酸0.03，MgSO47H2O0.4，KH2PO41，玉米漿25mL，豆餅水解液10mL，pH7.0。②搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80，味精10，黃嘌呤0.03，L-組氨酸0.03，酵母膏5，KH2PO41，MgSO47H2O0.4，(NH4)2SO45，CaCO320(干熱滅菌)，豆餅水解液15mL，玉米漿15mL，pH6.7，滅菌條件均為115℃，15min。培養(yǎng)基必要時添加5g/mL的紅霉素。③發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80，味精12，酵母膏18，葡萄糖酸鈉1.5，黃嘌呤0.03，L-組氨酸0.03，(NH4)2SO412，MgSO47H2O5，K2HPO42，MnSO40.06，F(xiàn)eSO40.06，CaCl22，玉米漿15mL，pH6.7。華而不實葡萄糖分消滅菌，滅菌條件均為115℃，15min。工程菌種子培養(yǎng)基添加5g/mL的紅霉素。1.1.4主要試劑和儀器:SolutionI連接酶和RNA提取試劑盒，大連寶生物工程有限公司;TaqDNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶和1kbDNAmarker，F(xiàn)ermentas公司;UltraSYBR二步法熒光定量PCR試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，北京博邁德生物技術(shù)有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司;引物合成與基因測序，北京華大基因。實時定量PCR儀，美國ABI公司;電穿孔儀，Eppendorf公司;高效液相色譜系統(tǒng)，美國安捷倫公司。1.2感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的制作方式方法與轉(zhuǎn)化方式方法以下為參考文獻(xiàn)，載體連接化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備及質(zhì)粒連接體系轉(zhuǎn)化均參照連接試劑盒和化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑盒講明書進(jìn)行。1.3實時定量PCR分析將B．subtilisXGL和B．subtilisXGLF菌株接于5mL搖管過夜培養(yǎng)，以1%的接種量接種于30mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，根據(jù)RNA提取試劑盒講明書提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，并以之為模板，以細(xì)菌16SrRNA為參比，通過實時定量PCR，根據(jù)2－CT法計算相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。1.4PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性檢測粗酶液的制備、蛋白質(zhì)定量分析和PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性分析參見文獻(xiàn)。1.5細(xì)胞內(nèi)IMP含量測定胞內(nèi)IMP含量的測定參考Mller等的方式方法，胞內(nèi)IMP含量的測定改良如下:取生長至對數(shù)期的菌液1mL，冰浴5min，然后10000g，4℃離心1min，棄上清后參加250L去離子水重懸，參加3L50mg/mL的溶菌酶，37℃處理20min，參加250L細(xì)胞裂解液，混勻后室溫下靜置5min，然后參加約350L的細(xì)胞中和液，10000g，離心15min，取上清利用HPLC方式方法測定IMP的含量。1.6發(fā)酵培養(yǎng)及分析方式方法搖瓶培養(yǎng)條件以下為參考文獻(xiàn)，發(fā)酵周期為48h。發(fā)酵罐培養(yǎng)條件以下為參考文獻(xiàn)，發(fā)酵經(jīng)過中，取適量發(fā)酵液稀釋20倍后用紫外可見分光光度計測定600nm處的吸光度值，監(jiān)測菌體生長情況。葡萄糖濃度采用SBA-40E生物傳感儀測定。另取適量發(fā)酵液離心后取上清，用去離子水稀釋100倍，將得到的稀釋液用高效液相色譜法測定腺苷含量。2、結(jié)果2.1整合質(zhì)粒的構(gòu)建以pKS1質(zhì)粒為基本骨架構(gòu)建整合質(zhì)粒pKF。分別以質(zhì)粒pWB980與腺苷生產(chǎn)菌B．subtilisXGL的基因組為模板，引物分別為P43-S、P43-A和purF-S、purF-A擴(kuò)加強(qiáng)啟動子P43與基因purF。采用重疊PCR的方式方法擴(kuò)增重疊片段P43-F，以上述PCR產(chǎn)物為模板，P43-S、purF-A為上下游引物進(jìn)行重疊PCR，擴(kuò)增出重疊片段P43-F。經(jīng)限制性內(nèi)切酶PstI和KpnI雙酶切重疊片段和溫敏質(zhì)粒pKS1，切膠法回收重疊片段和載體，通過SolutionI連接，構(gòu)建整合質(zhì)粒pKF。2.2質(zhì)粒pKF整合B．subtilisXGL重疊片段中purF基因作為與基因組進(jìn)行整合的位點(diǎn)，通過單交換整合的方式將質(zhì)粒pKF整合到基因組上，使強(qiáng)啟動子P43插入到基因組purF基因的上游。構(gòu)建步驟如此圖1所示。2.3相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析通過單交換整合的方式，將強(qiáng)啟動子P43插入嘌呤操縱子中，以加強(qiáng)嘌呤合成途徑的通量。purF、purM、purN、purH和purD作為緊鄰P43啟動子后的基因，其mRNA含量能夠反映嘌呤操縱子的轉(zhuǎn)錄水平。本文對相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行RT-qPCR分析，與出發(fā)菌株B．subtilisXGL相比，purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表示出水平在工程菌B．subtilisXGLF菌株中均有不同程度的提高，分析結(jié)果見表3。2.4PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性分析PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶是嘌呤合成途徑中的第一個酶，催化5-磷酸核糖焦磷酸生成5-磷酸核糖胺，而且是肌苷酸IMP合成的限速酶，其活性的高低直接影響嘌呤前體物IMP的生成，進(jìn)而影響腺苷的合成量。酶活性分析結(jié)果(圖2)表示清楚purF基因的過表示出使工程菌B．subtilisXGLF的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活力到達(dá)19.2U/g，是出發(fā)菌株B．subtilisXGL的2.4倍。2.5胞內(nèi)IMP含量分析IMP主要是在枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑中生成的，其含量能夠直接表征嘌呤合成途徑通量的強(qiáng)弱。除此之外，IMP還是腺苷合成的重要前體物，IMP的供給會直接影響腺苷的合成，因而，本文對枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)IMP的含量進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表示清楚，工程菌B．subtilisXGLF胞內(nèi)IMP含量明顯高于出發(fā)菌B．subtilisXGL，講明P43啟動子的插入能夠加強(qiáng)嘌呤途徑合成通量，進(jìn)而可增加腺苷前體物IMP的供應(yīng)量。出發(fā)菌B．subtilisXGL和工程菌B．subtilisXGLF胞內(nèi)IMP含量見圖2。2.6腺苷發(fā)酵為了研究嘌呤合成途徑的改造對腺苷積累的影響，本研究進(jìn)行了腺苷搖瓶發(fā)酵和5L發(fā)酵罐腺苷發(fā)酵，分別比擬了出發(fā)菌和工程菌的生長情況、耗糖速率和腺苷產(chǎn)量。表4為腺苷搖瓶分批發(fā)酵48h后的發(fā)酵參數(shù)。由結(jié)果可知，與出發(fā)菌B．subtilisXGL比擬，嘌呤合成途徑改造后的工程菌腺苷產(chǎn)量提高17.5%，糖苷轉(zhuǎn)化率提高26.1%，但是菌體生物量卻有所減少。由于嘌呤合成途徑的改造提高了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表示出，另外，整合的重組質(zhì)粒pKF約5.5kb，還包含了抗性基因，這些都可能增加了工程菌生長代謝的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致菌體生長遭到影響。除此之外，本研究在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行了腺苷的分批發(fā)酵實驗。結(jié)果顯示(圖3)，在同樣投入80g/L葡萄糖的情況下，出發(fā)菌B．subtilisXGL發(fā)酵32h后葡萄糖已消耗完，但腺苷對葡萄糖得率僅有0.092g腺苷/g葡萄糖;然而在同樣發(fā)酵時間下，工程菌B．subtilisXGLF的腺苷對葡萄糖得率為0.123g腺苷/g葡萄糖。3、討論本實驗室前期工作中曾經(jīng)利用穿梭表示出質(zhì)粒pBE43，構(gòu)建含有PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶編碼基因purF的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入腺苷生產(chǎn)菌B．subtilisXGL，試圖增加嘌呤合成途徑中限速酶量來增加腺苷合成前體物的生成，進(jìn)而提高腺苷的產(chǎn)量。但實驗結(jié)果表示清楚，單獨(dú)過表示出PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶不能提高腺苷產(chǎn)量，這可能是由于單個基因的過表示出會導(dǎo)致胞內(nèi)代謝通量失衡，并使終產(chǎn)物合成途徑中的某種中間產(chǎn)物積累太多而對細(xì)胞造成毒性。本研究基于代謝工程理論，對枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑進(jìn)行了改造，利用單交換的方式將P43啟動子插入嘌呤操縱子中基因purF上游，增加關(guān)鍵酶基因purF及相關(guān)基因purM、purN、purH和purD的轉(zhuǎn)錄表示出水平，到達(dá)了嘌呤合成途徑加強(qiáng)的目的。本研究中工程菌B．subtilisXGLF積累腺苷的能力加強(qiáng)，可能是由于P43啟動子的插入使purF、purM、purN、purH和purD的表示出強(qiáng)度得到了不同程度的加強(qiáng)。這些基因編碼的產(chǎn)物谷氨酰胺、甘氨酸和10-甲醛四氫葉酸均是嘌呤合成的前體物，同時也是嘌呤途徑的重要節(jié)點(diǎn)，改變這些分支節(jié)點(diǎn)的通量比例，使更多的嘌呤前體物進(jìn)入嘌呤合成途徑，提高嘌呤合成途徑通量，進(jìn)而提高腺苷產(chǎn)量。除此之外，本研究選擇在嘌呤操縱子的purF位點(diǎn)上游插入強(qiáng)啟動子，主要是由于purF編碼蛋白為嘌呤合成途徑的限速酶，該酶的過表示出有助于解決代謝瓶頸。本研究通過單交換整合的基因操作除了到達(dá)提高關(guān)鍵基因拷貝數(shù)的目的，還將龐大的嘌呤操縱子分成了2個較小的操縱子，進(jìn)而提高嘌呤合成代謝中其它基因的轉(zhuǎn)錄水平。細(xì)胞內(nèi)IMP含量的測定結(jié)果顯示工程菌B．subtilisXGLF胞內(nèi)IMP含量升高，這講明工程菌嘌呤合成途徑得到了加強(qiáng)，嘌呤操縱子的改造到達(dá)了預(yù)期