用熒光顯微鏡結構及觀察口腔上皮細胞的

實驗目的實驗原理儀器、材料與試劑實驗步驟實驗報告及思考題第1頁/共22頁第一頁，共23頁。

實驗目的了解熒光顯微鏡的基本構造和基本光路了解熒光探針Hoechst33258或33342與細胞成分的結合特性和光譜特性第2頁/共22頁第二頁，共23頁。熒光顯微鏡第3頁/共22頁第三頁，共23頁。什么是熒光?

物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。即：物質吸收短波光，發(fā)射出的長波光。一種光化熒光第4頁/共22頁第四頁，共23頁。熒光的種類自發(fā)熒光次生熒光自發(fā)熒光：物質受光激發(fā)產生的固有熒光次生熒光：物質借熒光色素受光激發(fā)產生的熒光第5頁/共22頁第五頁，共23頁。熒光的性質吸收光保持固有的熒光特性熒光波長＞激發(fā)波長（STOKES法則）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率第6頁/共22頁第六頁，共23頁。落射熒光顯微鏡的構造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護罩孔徑光欄（FS）視場光欄（AS）第7頁/共22頁第七頁，共23頁。落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

汞燈光源:提供激發(fā)光(UV、B、G)

激發(fā)濾色鏡:波長選擇nmT%BANDPASS第8頁/共22頁第八頁，共23頁。第9頁/共22頁第九頁，共23頁。第10頁/共22頁第十頁，共23頁。落射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡

標本第11頁/共22頁第十一頁，共23頁。第12頁/共22頁第十二頁，共23頁。第13頁/共22頁第十三頁，共23頁。濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收—根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡第14頁/共22頁第十四頁，共23頁。實驗原理

熒光顯微鏡技術是利用一定波長的光（通常是波長短的紫外光和藍紫光）照射被檢樣品，樣品獲得能量，產生能量躍遷，從基態(tài)到汽激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到原態(tài)，放出光和熱能，產生的光為波長較長的光（相對于激發(fā)光波長），此可見光稱為熒光。通過物鏡、目鏡的成像、放大，以供觀察、檢測和拍攝。

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熒光顯微鏡要求有特殊的光源提供足夠強度和較短波長的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質發(fā)出較長波長的熒光。視野中所看到的像，主要是樣品的熒光映像。熒光顯微鏡技術是在光學顯微鏡水平上對蛋白質和亞細胞組分進行定位的最常用的方法之一。非免疫熒光探針可用來直接標記許多特殊的亞細胞組分及生物大分子。這些探針大多數(shù)能被活細胞直接攝取并摻入和聚集在特定的細胞器中，因此我們就可以通過熒光顯微鏡對這些細胞器進行觀察。第16頁/共22頁第十六頁，共23頁。Hoechst33258是一種親脂性物質，可跨膜進入活細胞，與DNA特異性結合，它主要結合在富含AT區(qū)域的DNA小溝部分。結合DNA后熒光大大增強，最大激發(fā)光波長約為350nm,最大發(fā)射光波長約為461nm?？捎糜诨罴毎^察，不需要對細胞作固定及透化處理。第17頁/共22頁第十七頁，共23頁。儀器、材料與試劑儀器：熒光顯微鏡，材料：口腔粘膜上皮細胞，載玻片，牙簽試劑：PBS(pH7.4)Ho.33258orH.33342（10μg/mL，溶于PBS)

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實驗步驟在1張載玻片上分別滴加一滴PBS溶液用牙簽刮取口腔上皮細胞，分別涂于載玻片上（牙簽在液滴中攪勻）在涂細胞處分別滴加10μg/mL的Hoechst.33342蓋片——室溫暗處孵育2-3分鐘用紫外光激發(fā)，觀看細胞DNA熒光第19頁/共22頁第十九頁，共23頁。注意事項蓋片時防止產生氣泡滴加的染料不宜太多，否則背景太深，影響觀察注意避光，包括制片、熒光觀察和探針保存操作時防止污染皮膚和環(huán)境第20頁/共22頁第二十頁，共23頁。口腔粘膜上皮.jpg第21頁/共22頁第二十一頁，共23頁。感謝您的觀看！第22頁/共22頁第二十二頁，共23頁。內容總結實驗目的。了解熒光探針Hoechst33258或33342與細胞成分的結合特性和光譜特性。熒光強度極小于激發(fā)光的強度。提供激發(fā)光(UV、B、G)?！鶕?jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡。通過物鏡、目鏡的成像、放大